不久前，加州大学圣地亚哥分校（UCSD）张康教授团队的研究荣登《细胞》杂志封面，为患者们带来了一款能准确诊断多种疾病的人工智能算法。近日，张康教授和复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼科研究院院长和眼科主任卢奕教授合作再次在顶尖学术刊物上发表文章——在最新一期的《新英格兰医学杂志》（NEJM）上，卢奕教授与张康教授对近期视网膜细胞重编程用于再生疗法的重大进展进行了详尽的介绍。

▲本研究的作者张康教授（左）与卢奕教授（右）（图片来源：UCSD / 复旦大学）

哺乳动物为何缺乏再生能力？

视网膜对人类的视觉至关重要。据统计，全世界目前有超过5000万名患者受不可逆性眼盲症的困扰，而其中最主要的病因，就是视网膜神经元的退化。因此，找到能延缓、甚至是逆转退化进程的方法，也就成了当下研究人员们的攻坚方向。

在非脊椎动物里，研究人员们看到了希望——以鱼类为例，当它们的视网膜受损后，会启动“去分化”和“细胞重编程”的过程，使内源的Müller胶质细胞（Müller glia）增殖并分化成多种不同类型的视网膜细胞，重塑视觉。如果能在眼疾患者的体内重现这一进程，不就能恢复他们的视力吗？没那么简单。和鱼类相比，哺乳动物的再生能力几乎为零。想要重现，谈何容易？

▲鱼类中的实验结果，无法简单在哺乳动物里重复（图片来源：By Oregon State University (Zebrafish)）

在鱼类里的进一步研究，让我们对再生能力背后的分子机理有了更深的了解。想要让Müller胶质细胞去分化、重编程为视网膜神经元，需要重新激活特定的基因。这和胚胎发育时，视网膜多能祖细胞发育成视网膜神经元所需要激活的基因相似。

这一发现给研究人员们带来了新的启示。他们发现在斑马鱼的视网膜受损后，一种叫做Ascl1的转录因子在Müller胶质细胞中的表达水平会上调，这对于视网膜的再生是必须的。而当哺乳动物的视网膜受损后，Ascl1却不会表达。这是鱼类和哺乳动物再生能力区别的关键吗？

视网膜再生的突破

为了检验这个想法，美国华盛顿大学的Thomas A. Reh教授团队通过基因工程的手段，让小鼠的Müller胶质细胞表达Ascl1。这一看似简单的实验取得了令人欣喜的效果——无论是在体外实验还是在体内实验里，Ascl1的表达都能刺激视网膜神经细胞的再生。乍一看来，我们已经掌握了在哺乳动物中促进视网膜再生的关键。

但好景不长。研究人员们很快发现，即便Ascl1处于持续的过量表达中，这种再生能力依旧会在小鼠出生后的第16天消失。这表明Ascl1并非是视网膜再生的唯一关键要素。而随着再生能力的下降，Müller胶质细胞的染色质“可及性”也有所降低，这意味着许多再生所需基因的表达可能得到了抑制，背后则是表观遗传上的调控。

▲该研究的图示（图片来源：《NEJM》）

为了克服这一障碍，研究人员们决定双管齐下，一方面利用遗传改造的方法，提高Müller胶质细胞中的Ascl1表达，另一方面用表观遗传学方法在这些细胞中注射组蛋白脱乙酰酶抑制剂，让包括Ascl1在内的诸多转录因子能更好地促进下游基因的表达。而结果也正如研究人员们所料：改进之后，这些Müller胶质细胞转变为视网膜神经元的效率有了大幅提高，且分化出的视网膜神经元能与现有的神经元形成突触，整合入视网膜的神经环路中，并随光的刺激产生电势。换句话说，这些新形成的细胞具有正常生理功能。此项研究最近在《自然》发表。

卢奕教授与张康教授在综述中指出这项研究有着重要的直接医疗价值——一般来说，体内的原位细胞重编程相较传统的干细胞疗法，发生感染或排斥风险更低、形成肿瘤的可能也更小。在眼科疾病的治疗上，这款再生疗法倘若能在人体中得到验证与推广，在患者眼中诱导产生感光细胞和视网膜神经节细胞，那将会是是患者的一大福音。

细胞再生疗法的前景

这篇综述还指出，从广义上看，细胞再生疗法有望以一种巧妙的方式对视网膜色素变性和黄斑变性在内的严重眼疾进行治疗——视网膜色素变性是一类极为多样性的遗传病，病因可以追溯到200多个不同基因和上万个突变。倘若设计逐一基因治疗来修正每个突变基因，即便可行，效率也极低且成本太高。2017年，张康教授团队在《Cell Research》上发文，介绍了其最新以一种基因剪辑方法，来治疗所有视网膜色素变性病人。研究人员们指出，导致视网膜色素变性的基因突变主要影响视杆细胞，在造成这些细胞退化和失去功能之后，还会进一步影响到视锥细胞，导致视力精确度下降，色彩感知力变差。

有趣的是，人体中的视杆细胞数量远多于视锥细胞。据估计，视网膜里大约有600万个视锥细胞，而视杆细胞的数量高达1.2亿，是前者的20倍。利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，张康教授团队成功敲除了视杆细胞里的Nrl和Nr2e3基因。作为控制细胞命运的“开关”，Nrl与它下游的转录因子Nr2e3能促进视杆细胞的分化与形成。而一旦这些基因不再起作用，视杆细胞就能变成视锥细胞。理论上说，尽管这些细胞内依旧带有导致视网膜色素变性的突变，但由于视锥细胞不易受这些突变的影响，因此可以让突变“无效化”，从而维持组织功能。而视杆细胞庞大的数量，也让细胞类型转变带来的影响降到了最低。

▲小鼠实验验证了这一思路的可行性（图片来源：《Precision Clinical Medicine》）

动物实验中，研究人员们用两种不同的小鼠视网膜色素变性模型验证了这一思路的可行性。研究发现，在CRISPR-Cas9基因编辑技术的作用下，随着Nrl和Nr2e3基因的“失活”，大量视杆细胞被重编程为了视锥细胞，且维持了视网膜中应有的正常细胞结构。而视网膜电图测试则进一步表明，小鼠的电生理功能和视力的确得到了明显的改善。

“原位细胞重编程还有一个好处，就是不需要引入外部细胞。就像给花草移盆容易给植物带来损伤一样，外部移入的细胞也不一定能适应新的环境，”张康教授评论道：“但原位细胞重编程技术不一样。新转变而来的视锥细胞在自身视网膜里土生土长，对周围的环境很适应，不会水土不服。”

当然，要想让再生疗法走到寻常患者身边，我们还有不少的路要走。由于人类视网膜结构的独特性，在人类临床试验之前，我们还需要在灵长类动物模型中测试这款疗法的安全性与有效性。可喜的是，据了解，张康教授团队已在灵长类动物模型中做了试验，安全性和效果很好。预计2018年底前进行临床试验。2017年，我们迎来了首款CAR-T疗法与首款人体内基因疗法的获批。我们同样期待不久后能看到再生疗法在眼科取得突破。无论是对于科研人员，还是对于患者，前方充满光明！

参考资料：

[1] Lu Y and Zhang K, Cellular Reprogramming in the Retina — Seeing the Light. NEJM 2018

[2] Jorstad NL, Wilken MS, Grimes WN, et al. Stimulation of functional neuronal regeneration from

Müller glia in adult mice. Nature 2017;548:103-7

[3] Zhu J, Ming C, Fu X, et al. Gene and mutation independent therapy via CRISPR-Cas9 mediated cellular reprogramming in rod photoreceptors. Cell Res 2017;27:830-3.