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溶血性链球菌检验

来源：- 浏览：1659 更新时间：2011年12月02日

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链球菌（Streptococcus）在自然界中分布较广，在人体正常寄居鼻咽腔和肠道，常可引起咽峡炎、扁桃体炎、肺炎等，也可引起猩红热、产褥热等急性感染，还可通过食品引起食物中毒。根据其抗原结构，族的特异性“C”抗原的不同，可进行血清学分族，按其在血平板上的溶血情况可分为甲类溶血性链球菌、乙类溶血性链球菌、丙类溶血性链球菌。与人类疾病有关的大多属于乙类溶血性链球菌，其血清学分族为A、C、G族，其中A族占90%。近年来报导B族也可引起急性感染。

第一节溶血性链球菌标准检验方法

一、检验方法
（一）一般培养
称取25g固体检样，加入225ml灭菌生理盐水，研成匀浆，制成混悬液；液体检样可直接吸取。将上述混悬液或液体检样5ml接种于50ml葡萄糖肉浸液肉汤内，或直接划线接种平血平板，如检样污染较严重，可同时按上述量接种匹克氏肉汤，经36±1℃培养24h，接种血平板，置36±1℃培养24h，挑取乙型溶血圆形突起的细小菌落，在血平板上分纯，然后观察溶血情况及革兰氏染色，并进行链激酶试验及杆菌肽敏感试验。
其染色形态为革兰氏阳性球菌，呈圆形或卵圆形，直径0.5~1μm，链状排列，链长短不一，短者4~8个细胞组成，长者20~0个，链的长短常与细菌的种类及生长环境有关；液体培养中易呈长链；在固体培养基中常呈短链。
（二）培养特性
该菌营养要求较高，在普通培养基上生长不良，在加有血液，血清培养基中生长较好。乙类溶血性链球菌在血清肉汤中生长时，管底呈絮状或颗粒状沉淀。血平板上菌落呈灰白色，半透明或不透明，表面光滑，有乳光，直径约0.5~0.75mmm的细小菌落，乙型溶血性链球菌周围有2~4mm界限分明、无色透明的溶血圈。
（三）链激酶试验
致病性溶血性链球菌能产生链激酶（即溶纤维蛋白酶），此酶能激活正常人体血液中血浆蛋白酶原，使成血浆蛋白酶，而后溶解纤维蛋白。
吸取草酸钾血浆0.2ml（草酸0.01g，加入5ml人血混匀，经离心沉淀，吸取上清液，即为草酸钾血浆），加入0.8ml灭菌生理盐水，混匀，再加入18~24h链球菌肉汤培养物0.5ml及0.25%氯化钙0.25ml，振荡摇匀。置36±1℃水浴中每隔数分钟观察一次，一般约10min即可凝固，血浆凝固后，再注意观察及记录溶化的时间。溶化时间愈短，表示该菌产生的链激酶愈多，含量多时，20min内凝固的血浆即完全溶解。如无变化，应在水浴中持续放置24h后再观察，如凝块全部溶解为阳性，24h后仍不溶解者为阴性。
（四）杆菌肽敏感试验
挑取乙类溶血性链球菌浓菌液，涂布于血平板（肉浸液琼脂加入5%脱纤维羊血）上，用灭菌镊子平取每片含有0.04单位的杆菌肽纸片，放于上述平板上，于36±1℃培养18~24h，如有抑菌带出现即为阳性，同时用已知阳性菌株作为对照。
（五）检验程序
溶血性链球菌的检验程序如图13-1。

图13-1 溶血性链球菌的检验程序

二、结果分析判定
（一）在血平板上生产有细小菌落，溶血环呈完全溶血，如不易与甲类溶血链球菌分辨时，可在低倍显微镜下，观察菌落周围溶血环，如有残存红细胞即为甲类溶血链球菌，如呈完全透明的溶血圈即为乙类溶血链球菌，进行革兰氏染色镜检，为阳性球链状排列，当在含有血清的肉浸液肉汤中培养后吸取管底沉淀物染色时，其链会更长。链激酶试验为阳性，可报告为乙类溶血链球菌，杆菌肽敏感试验敏感可推测为A族乙类溶血链球菌。
（二）链激酶试验：进行该项试验时，一定要用以草酸钾作为抗凝剂的人血浆。在加入0.25%氯化钙以后，血浆一定呈现凝固，如不凝固可能氯化钙潮解，可提高氯化钙浓度，待完全凝固后，再放入水浴，开始计算完全溶解的时间，完全溶解为阳性。
（三）杆菌肽敏感试验：在杆菌肽周围只要有狭小的抑菌带即可判断为敏感。
三、培养基
（一）肉浸液肉汤
成分：

绞碎牛肉	500g
氯化钠	5g
蛋白胨	10g
磷酸氢二钾	2g
蒸馏水	1000ml

制法：将绞碎之去筋膜和油脂的牛肉500g加蒸馏水1000ml，混合后放冰箱过夜，除去液面之浮油，隔水煮沸半小时，使肉渣完全凝结成块，用绒布过滤，并挤压收集全部滤液，加水补足原量。加入蛋白胨、氯化钠和磷酸盐，溶解后校正pH7.4~7.6，煮沸并过滤，分装烧瓶，121℃高压灭菌30min。
（二）葡萄糖肉浸液肉汤
成分：

肉浸液肉汤	1000ml
葡萄糖	10g

制法：溶化后分装试管或烧瓶，每管50ml。115℃高压灭菌20min。
（三）血琼脂平板
成分：

肉浸液肉汤	1000ml
琼脂	120~25g
脱纤维羊血	50~100ml

制法：肉浸液肉汤（pH7.4）加入琼脂溶化后121℃高压灭菌30min，待冷至60~50℃，加入脱纤维羊血，混匀倒平板。
（四）匹克氏肉汤
成分：

含1%胰蛋白胨的牛心浸液	200ml
1:25000结晶紫盐水溶液	10ml
1:800三氮化钠溶液	10ml
脱纤维兔血（或羊血）	10ml

制法：将上述已灭菌的各种成分用无菌手续依次混合，分装于无菌试管内，保存于冰箱内备用。

第二节溶血性链球菌参考检验方法

一、一般培养
样品稀释与接种同标准方法，在混有大量杂菌的样品也可采用链球菌增菌肉汤，分离平板也可应用KF选择性平板。
二、生化试验
对人有致病性的大多为乙类溶血链球菌。链球菌依其抗原“C”的不同，可分为ABCDEFGHKLMNOPQRST共18个族，一般认为乙类溶血链球菌中A族引起致病的约占90%以上，其次CGB族。由于血清学分型比较复杂，需要一定条件，因此应用生物化学反应推测其血清型别（见表13-1），如对杆菌肽敏感可推测为“A”族，cAMP阳性、马尿酸钠阳性可推测“B”族，6.5%氯化钠生长、七叶苷水解阳性为“D”族。
1. 溶纤酶试验与杆菌肽敏感试验同标准方法。
2. cAMP试验：在羊血脂平板上接种一长条（即划一条线）金黄色葡萄球菌，将被检链球菌与金黄色葡萄球菌接种线垂直划1~2条线，两者间距离3mm，被检链球菌划线约2mm，用同样方法接种阴性和阳性对照菌。36±1℃培养18h。在上述两种菌接线之间葡萄球菌有一个箭头状的溶血即为阳性。
3. 马尿酸钠水解试验：将待检菌接种于马尿酸钠培养基，置36±1℃培养48h，用灭菌蒸馏水稀释到原培养基的高度（因高压灭菌后培养基失去一部分水分）。再将培养物离心沉淀，吸取上清液0.8ml，放入一小试管内，再加入氯化高铁试剂0.2ml立即混合，随时观察，如管内产生云雾状的沉淀，即为阳性。
表13-1 生化试验推测鉴定链球菌族

生化试验	溶血
乙类	乙类	乙类	甲类乙类	甲类丙类
杆菌肽敏感	+	－	－	－	－
马尿酸钠水解camp试验	－	+	－	－	－
胆汁七叶苷试验	－	－	－	+	+
6.5%盐生长	－	±	－	+	－
推测鉴定菌族	a族	b族	非a、b d族	d族肠球菌	d族非肠球菌

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