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青霉酸检测

来源：- 浏览：352 更新时间：2011年12月02日

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青霉酸（Penicillic acid）是橄榄绿青霉（Penicillium olivino-viride）、软毛青霉（P.puberulum）、赭青霉（P.ochraceum）等菌种产生的有毒代谢产物。青霉酸的化学命名为3-甲氧基-5-甲基-4氧代-2，5-乙二烯酸（3-methoxy-5-methy1-4-oxo-2, 5 hexadienoic acid）。化学结构式如下：

青霉酸是无色结晶化合物，主要污染玉米、干豆等，在果汁、大米、烟草、香肠、奶酪中也能检出。该毒素对枯草杆菌重组试验呈阳性反应；在大鼠皮肤上连续涂抹1mg青霉酸，可引起肿瘤。
本章介绍青霉酸的薄层色谱法。此法参考了“国际癌症研究机构”推荐的分析方法，取消了柱层析步骤，采用双相展开方法，简化了操作，提高了灵敏度。
一、适用范围
本方法适用于玉米中青霉酸的测定。
二、原理
玉米中的青霉酸经提取、净化、浓缩和硅胶G薄层展开后，用茴香醛显色，经加热产生一种在紫外光下显示蓝色荧光的物质，根据其在薄层板上显示的荧光最低检出量来测定样品中青霉酸的含量。
三、试剂
1. 三氯甲烷；
2. 乙酸乙酯；
3. 丙酮；
4. 冰乙酸；
5. 二氯甲烷；
6. 盐酸；
7. 硫酸；
8. 甲醇；
9. p-对甲基苯甲醛（茴香醛）：0.5mL p-对甲基苯甲醛于85mL甲醇：冰乙酸：浓硫酸（70+10+5）溶液中；
10. 碳酸氢钠；
11. 无水硫酸钠；
12. 硅胶G；
13. 青霉酸标准溶液：精密称取1mg青霉酸标准品，加二氯甲烷溶解，转入10mL溶量瓶中，加二氯甲烷（含0.05%冰乙酸）至刻度，此标准溶液每毫升含青霉酸100μg。吸取此标准溶液0.5mL，用二氯甲烷稀释至5mL，此溶液每毫升含青霉酸10μg。
四、仪器
1. 小型粉碎机；
2. 电动振荡器；
3. 75mL玻璃蒸发皿；
4. 底部具0.2mL刻度尾管具塞浓缩瓶；
5. 玻璃板：5cm×20cm；
6. 薄层涂布器：0.3mm；
7. 展开槽：内长25cm、宽6cm、高4cm；
8. 紫外光灯：波长365nm；
9. 微量注射器10μL，50μL。
五、操作步骤
（一）样品溶液的制备
称取20g粉碎样品，置300mL具塞锥形瓶中，加8mL0.01mol/L盐酸和80mL乙酸乙酯，振荡3min，通过折叠快速定性滤纸过滤，取滤液40mL于125mL分液漏斗中，加入3%碳酸氢钠溶液9mL，振摇30sS，将下层溶液放于25mL烧杯中，再分别两次用6mL3%碳酸氢钠溶液提取，合并提取液于25mL烧杯中，慢慢加入1mol/L盐酸，边加入边搅拌直至pH为3，转移此溶液于125分液漏斗中，加入12mL乙酸乙酯，振摇30s，转移下层溶液于另一个125mL分液漏斗中，加入12mL乙酸乙酯提取30s，弃去水溶液，合并乙酸乙酯提取液，并将此溶液经盛有5g无水硫酸钠的定量慢速滤纸滤于75mL蒸发皿中，最后用少量乙酸乙酯淋洗滤器。将蒸发甲置水浴上通风蒸发溶液约5mL时，转移至10mL浓缩瓶中，用少量乙酸乙酯洗蒸发皿，并将其放入浓缩瓶中，在水浴上将溶液浓缩至干，室温冷却后加0.2mL二氯甲烷溶解残渣，供薄层点样用。
（一）薄层层析
1. 薄层板的制备：向8g硅及G中加22mL蒸馏水，研磨至糊状后，立即倒入涂布器中，推成5cm×20cm的薄层板6块，室温干燥后，于105℃活化1.5h，取出，放干燥器中备用。
2. 展开剂：乙酸乙酯-三氯甲烷-冰乙酸（7+7+0.2）；横展剂：三氯甲烷-丙酮（9.3+0.7）。
3. 点样：在每块薄层板上距下端2.5cm基线上点样。
第一块板：在距薄层板左边缘0.7cm处点样液20μL，在距左边缘2.5cm处点标准液5μL（50μg）。
第二块板：在距薄层板左边缘0.7cm处点样液20μL和标准液5μL，在距左边缘2.5cm处点标准液5μL（50μg）。
4. 展开
纵展：在展开槽内倒入15mL纵展剂，将点样后的薄层板点样端浸入溶剂中，展至15cm（约需30min），取出，通风挥干。
横展：在另一展开槽内倒入10mL横展剂，将纵展后的薄层板靠样液点的长边浸入溶剂中，展至板端过2.5min，取出，通风挥干10min。
5. 显荧光：在薄层板上喷p-对甲基苯甲醛溶液，使板面略潮湿。置130℃，加热8min，室温放置30min后，在波长365nm紫外光下观察。
（三）观察与评定
将薄层板置紫外光灯下观察，薄层板经横展后，青霉酸点均有移动，样品中的青霉酸点约0.5cm，正好与杂质荧光分开。如在第一块板上样液点未显荧光，而在第二块板上样液点加标准点（50ng）显示的荧光强度与标准点（50ng）的荧光强度相等，则样品中青霉酸的含量小于50μg/kg；若第一块板样液点荧光强度比标准点强，则根据其荧光强度估计减少滴加的微升数，或将样液稀释后再在第一块和第二块薄层板上滴加不同的微升数，直至第一块板上样液点的荧光强度与标准点的荧光强度相等，第二块上样液点的荧光强度比标准点的荧光强度强一倍为止。
（四）计算

式中：X——样品中青霉酸的含量，μg/kg；
0.05——青霉酸的最低检出量，μg；
V1——加入二氯甲烷溶解残渣的体积，mL；
V2——出现最低荧光时滴加样液的体积，mL；
D——样液的总稀释倍数；
m——加入二氯甲烷溶解残渣时相当样品的质量，g。
（五）注意事项
1. 在样品浓缩液中加入一点5%冰乙酸，点样后将薄层板置干燥器中放置过夜，再展开，则荧光点更集中，清晰。
2. 喷显色剂时，要喷至整个薄层板微微潮湿。若显色剂不够，加热后，薄层板发红，影响观察。

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