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霉菌和酵母计数

来源：- 浏览：2384 更新时间：2011年12月02日

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霉菌和酵母广泛分布于自然界并可作为食品中正常菌相的一部分。长期以来，人们利用某些霉菌和酵母加工一些食品，如用霉菌加工干酪和肉，使其味道鲜美；还可利用霉菌和酵母酿酒、制酱；食品、化学、医药等工业都少不了霉菌和酵母。但在某些情况下，霉菌和酵母也可造成食品腐败变质。由于它们生长缓慢和竞争能力不强，故常常在不适于细菌生长的食品中出现，这些食品是pH低、湿度低、含盐和含糖高的食品、低温贮藏的食品，含有抗菌素的食品等。由于霉菌和酵母能抵抗热、冷冻，以及抗菌素和辐照等贮藏及保藏技术，它们能转换某些不利于细菌的物质，而促进致病细菌的生长；有些霉菌能够合成有毒代谢产物——霉菌毒素。霉菌和酵母往往使食品表面失去色、香、味。例如，酵母在新鲜的和加工的食品中繁殖，可使食品发生难闻的异味，它还可以使液体发生混浊，产生气泡，形成薄膜，改变颜色及散发不正常的气味等。因此霉菌和酵母也作为评价食品卫生质量的指示菌，并以霉菌和酵母计数来制定食品被污染的程度。目前已有若干个国家制订了某些食品的霉菌和酵母限量标准。我国已制订了糕点和蜜饯食品中霉菌和酵母的限量标准，其他食品霉菌和酵母的限量标准也在制订中。

第一节霉菌和酵母计数标准检验方法

一、检验方法
（一）霉菌和酵母计数（倾注法）
1. 适用范围
本方法适用于测定各种粮食、食品和饮料中霉菌和酵母的计数。
2. 设备和材料
（1）温箱：25~28℃；
（2）振荡器；
（3）天平；
（4）显微镜；
（5）玻塞锥瓶：300mL；
（6）试管：15mm×150mm；
（7）平皿：直径9cm；
（8）吸管：1mL及10mL；
（9）酒精灯；
（10）载物玻片；
（11）盖玻片；
（12）金属勺、刀等；
（13）试管架；
（14）橡皮乳头。
3. 操作方法
（1）检样稀释及培养。①以无菌操作将检样（块状食品需剪碎后置灭菌乳钵磨碎）25g（或25mL）放入含有225mL灭菌沙丘带玻塞锥瓶中，振摇30min，作成1：10的均匀稀释液。②用10mL灭菌吸管吸取10mL稀释液，注入灭菌试管中，另用带橡皮乳头的1mL灭菌吸管反复吹吸50次左右，使霉菌孢子充分散开。吸取此1：10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌水的试管中（注意吸管尖端不要触及试管内稀释液），另换一支1mL灭菌吸管吹吸稀释液使其充分混合均匀，作成1：100的稀释液。③吸取1mL1：100稀释液于含有9mL灭菌水的试管中，按上项操作顺序作10倍递增稀释液，每递增稀释一次，即换用一支吸管。④根据食品卫生标准要求或对样品污染的情况的估计，选择3个适宜的稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，吸取1mL稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度作两个平皿。⑤稀释液移入平皿后，应立即将凉至45℃左右的培养基约15mL注入平皿中，并转动平皿使混合均匀。⑥待琼脂凝固后，翻转平板，置25~28℃温箱中，3d后开始观察，共培养观察5d。
（2）菌落计数方法。做平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度各平板的平均菌落数。
（3）霉菌和酵母计数的报告。选取菌落数在10~150之间的平板作为霉菌和酵母计数的标准。一个稀释度使用两个平板。应采用两个平板的平均数乘以稀释倍数，即为每克或每毫升检样中所含霉菌和酵母计数，以个/g（或个/mL）表示。
（4）检验程序

图17-1 霉菌和酵母计数检验程序

（二）霉菌直接镜检计数法
常用的方法为郝氏霉菌计数法，或称霍华德（Howard）霉菌计数法。
1. 适用范围
本方法适用于各种加工的水果和蔬菜制品，如番茄酱、果酱和果汁等。霉菌可以作为一种指示菌，表明加工制品的原料有霉菌所致的腐烂存在。此法系在一个标准计数玻片上计数含有霉菌菌丝的显微镜视野。
2. 设备和材料
（1）显微镜：霉菌直接计数用的双筒显微镜一定要有标准化视野，在90~125倍时视野直径为1.382mm。同时在一个目镜中装配有一个特制的测微玻璃圆盘，其上刻有每边长度相当于视野直径1/6的36个小方格；
（2）郝氏计测玻片：系特制的玻璃载片，带有一个20mm×15mm的长方形平面，即计测室，其周围有沟，两侧各有一条高出长方形平面0.1mm的肩堤，盖片放在肩堤上面，盖片和长方形平面之间相距0.1mm。中央长方形平面，肩堤和盖片共同形成一个光学工作面。为了便于校正显微镜，计测玻片上刻有两条相距1.382mm的平行线，作为校正显微镜视野的标准线；
（3）烧杯、玻璃棒等；
（4）折光仪；
（5）盖玻片；
（6）稳定液：0.5%羧甲基纤维素钠（sodium carboxymethy-cellulose）溶液。在高速搅拌器的杯中加入500mL沸水，加2.5g纤维树胶和10mL约为37%的甲醛，混合约1min，也可用3%~5%果胶或1%藻胶代替。用真空或加热的方法去除溶液中的气泡，调节pH至7.0~7.5。如无搅拌器，则可将干燥的稳定剂与酒精混合，以促进其在水中的溶解。
3. 操作方法
（1）用蒸馏水清洗郝氏计测玻片和盖片，擦干后，将盖片压在计测玻片的肩堤上，观察玻片和盖片之间形成的牛顿环，如无牛顿环，说明玻片和盖片不清洁，应重新清洗。
（2）采用8~12.5倍目镜和10倍物镜，用刻有间距1.382mm平行线的计测玻片调节视野为1.382mm。将特制测微圆盘放入目镜中，使其上方格每边为视野直径的1/6。
（3）样品制备：①番茄酱：用小烧杯称取约10g样品，加蒸馏水稀释至约30mL，用折光仪测定其折光指数为1.3447~1.3460，即浓度为7.9%~8.8%。②苹果酱：用小烧杯称取一定量的样品，加等量的稳定液制成样液。
（4）涂片：用玻璃棒将制好的样液均匀涂布于计测玻片中央平面计测室上，盖上盖片。
（5）观测：将计测玻片置显微镜下，用90-125倍的放大倍数检查每个视野。每个样品应检查2个玻片，每个玻片至少检查25视野，即一共应观测50个视野。
二、结果分析判定
（一）霉菌和酵母计数
1. 样品的处理和稀释。为了准确测定霉菌和酵母数，真实反映被检食品的卫生质量，首先应注意样品的代表性。对大的固体食品样品，要用灭菌刀或镊子从不同部位采取试验材料，再混合磨碎。如样品不太大，最好把全部样品放到灭菌均质器杯内搅拌2min。液体或半固体样品可用迅速颠倒容器25次来混匀。有的规定在实际操作时，振摇时振幅要30cm，7s振摇25次。
为了减少样品稀释倍数的误差，在连续递增稀释时，每一稀释度应更换一根吸管。
2. 培养基的选择
（1）马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基（PDA）：霉菌和酵母在PDA培养基上生长良好。用PDA作平板计数时，必须加入抗菌素以抑制细菌。
（2）孟加拉红（虎红）培养基：该培养基中的孟加拉红和抗菌素具有抑制细菌的作用。孟加拉红还可抑制霉菌菌落的蔓延生长。在菌落背面由孟加拉红产生的红色有助于霉菌和酵母菌落的计数。
（3）高盐察氏培养基：粮食和食品中常见的曲霉和青霉在该培养基上分离效果良好，它具有抑制细菌和减缓生长速度快的毛霉科菌种的作用。
3. 倾注培养。每个样品应作3个适宜的稀释度，每个稀释度倾注2个平皿。培养基熔化后冷却至45℃，立即倾注并旋转混匀，先向一个方向旋转，再转向相反方向，充分混合均匀。培养基凝固后，把平皿翻过来放温箱培养。培养温度25~28℃。培养3d后开始观察菌落生长情况，共培养5d观察记录结果。
4. 菌落计数及报告。选取菌落数在10~150之间的平板进行计数。一个稀释度使用两个平板，取两个平板菌落数的平均值，乘以稀释倍数报告之，固体检样以g为单位报告，液体检样以mL为单位报告。关于稀释倍数的选择可参考细菌菌落总数测定。
（二）霉菌直接镜检计数法
1. 霉菌菌丝的特征
（1）平行壁：霉菌菌丝呈管状，多数情况下，整个菌丝体的直径是一致的。因此在显微镜下菌丝壁看起来像两条平行的线。这是区别霉菌菌丝和其他纤维时最有用的特征之一。
（2）横隔：许多霉菌的菌丝具有横隔，毛霉、根霉等少数霉菌的菌丝没有横隔。
（3）菌丝内呈粒状：薄壁、呈管状的菌丝含有原生质，在高倍显微镜下透过细胞壁可见其呈粒状或点状。
（4）分枝：如菌丝不太短，则多数呈分枝状，分枝与主干的直径几乎相同，有分枝是鉴定霉菌最可靠的特征之一。
（5）菌丝的顶端：常呈钝圆形。
（6）无折射现象。
凡有以上特征之一的丝状体均可判定为霉菌菌丝。
2. 计算
观察视野中有无菌丝，凡符合下列情况之一者为阳性视野。
（1）一根菌丝长度超过视野直径1/6；
（2）一根菌丝长度加上分枝的长度超过视野直径1/6；
（3）两根菌丝总长度超过视野直径1/6；
（4）三根菌丝总长度超过视野直径1/6；
（5）一丛菌丝可视为一个菌丝，所有菌丝（包括分枝）总长度超过视野直径1/6；
根据对所有视野的观察结果，计算阳性视野所占比例，并以阳性视野百分数（%）报告结果。
计算公式：

3. 番茄酱罐头霉菌直接镜检计数标准
国际上一些国家及我国制订了番茄酱罐头霉菌直接镜检计数标准，以保证原料的卫生质量。表17-1为一些国家番茄酱罐头霉菌直接镜检计数标准。
表17-1 各国番茄酱罐头霉菌直接镜检计数标准

国别	阳性视野，%
美国	≤40
加拿大	≤50
澳大利亚	≤50
法国	标准级≤60，特级≤50
意大利	标准级≤65，特级≤50
英国	≤50
中国	≤50

三、培养基
（一）马铃薯-葡萄糖-琼脂
成分：

马铃薯	300g
葡萄糖	20g
琼脂	20g
氯霉素	0.1g
蒸馏水	1000mL

制法：将马铃薯去皮切块，加1000mL蒸馏水，煮沸10~20min。用纱布过滤，补加蒸馏水至1000mL。加入葡萄糖和琼脂，加热溶化。另用少量乙醇溶解氯霉素，加入培养基中，分装，121℃高压灭菌20min。
（二）孟加拉红琼脂
成分：

蛋白胨	5g
葡萄糖	5g
磷酸二氢钾	10g
硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）	1g
琼脂	20g
1/3000孟加拉红溶液	100mL
蒸馏水	1000mL
氯霉素	0.1g

制法：上述各成分加入蒸馏水溶解后，再加孟加拉红溶液。另用少量乙醇溶解氯霉素，加入培养基中，分装，121℃高压灭菌20min。
（三）高盐察氏培养基
成分：

硝酸钠	2g
磷酸二氢钾	1g
硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）	0.5g
氯化钾	0.5
硫酸亚铁	0.01g
氯化钠	60g
蔗糖	30g
琼脂	20g
蒸馏水	1000mL

制法：用蒸馏水加温溶解以上成分，分装后115℃灭菌30min。必要时，可酌量增加琼脂。
注：①分离食品和饮料中的霉菌和酵母可选用马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基和/或孟加拉
红培养基。
②分离粮食中的霉菌可用高盐察氏培养基

第二节霉菌和酵母计数参考检验方法

一、表面涂布平板法
（一）适用范围
本法适用于污染比较严重的样品。
（二）设备和材料
除倾注法需要的设备外，还需要涂布样品用的涂布器，即L棒，可用20cm长、直径约3.5mm的玻璃棒烧制合适的L棒。在距一端3cm处弯成直角，两端烧圆。
（三）操作方法
1. 样品的稀释：同“倾注法”。
2. 量取稀释液到平板上：用一支灭菌吸管吸取0.1mL（最多取0.5mL）待检稀释液放到琼脂平板表面。
3. 涂布稀释液：用一支灭菌L棒将0.1mL样液在平板表面涂布，每个平板用一支L棒。平板至少需干燥15min。
4. 培养与计数：同“倾注法”。
5. 报告：同“倾注法”。
二、粮食和其他粒状或块状食品的霉菌检验方法
（一）适用于粮食内部和其他粒状、块状食品霉菌的直接分离。
（二）设备和材料
1. 小镊子：浸泡于95%酒精中，使用时进行火焰烧灼灭菌；
2. 灭菌平皿；
3. 灭菌带盖锥形瓶：300mL；
4. 灭菌蒸馏水。
（三）操作步骤
1. 表面除菌；如系分离粮食或其他粒状食品，则在分离培养前，必需先除去粮粒表面的霉菌，国外多用1%次氯酸钠溶液杀灭粮食表面霉菌，再用无菌水洗涤。但对于脱壳的粮粒，次氯酸钠会或多或少地渗入粮粒内部。而影响霉菌的分离。因此常用无菌水多次洗涤的方法除去粮粒表面的霉菌。方法是：取样品10~20g，放入300mL灭菌带盖锥形瓶中，以无菌手续倒入灭菌蒸馏水，淹没1~2cm左右，盖好盖子，充分振摇1~2min，将水倒净，再换水振荡，如此反复洗涤10~20次，最后将水弃去，粮粒倒入无菌平皿中备用。
2. 接种方法：以无菌操作手续，用灭菌的小镊子将经表面除菌的粮粒胚部向下种在高盐察氏琼脂平板上，每块平板接种5~10粒，每份样品接种100粒。接种完毕后，立即置28℃培养，3d后开始观察，共培养5d后检查。
块状食品（糕点等）和其他固体食品（水果、甘蔗等）需用无菌操作手续将样品用灭菌剪子或刀子切碎后，再接种在含氯霉素的马铃薯-葡萄糖-琼脂平板或孟加拉红培养基平板上。每皿接种5~10粒。
3. 培养与观察：样品接种后，立即置28℃培养，3d后开始观察，共观察5d。
4. 报告：粮食的霉菌侵染率和菌落数。

来源:医药网-虎网医药-药械-资讯网 ( 责任编辑:sundy )

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