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核苷酸含量测定方法

来源：- 浏览：952 更新时间：2011年12月02日

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1 试剂
1.1 甲醇优级纯。
1.2 乙酸分析纯。
1.3 磷酸二氢钾分析纯。
1.4 磷酸氢二钾分析纯。
1.5 氨基固相萃取柱。
1.6 核苷酸标准储备溶液准确称量经100℃，4h干燥处理的标准品胞嘧啶核苷（GMP）100mg，脲嘧啶核苷（UMP）、腺嘌呤核苷（AMP）、鸟嘌呤核苷（GMP）、次黄嘌呤核苷（IMP）各40mg，加水定容至100mL。
1.7 核苷酸标准使用液将核苷酸标准储备溶液用0.25M，PH=3的磷酸二氢钾稀释100倍。
2. 仪器设备
2.1 高效液相色谱仪：附紫外检测器（UV）。
3. 分析步骤
3.1 样品处理
3.1.1 准确称取10g样品于100mL容量瓶中，加入约50℃热水80mL，彻底混匀。当样品液达到室温后用水定容至刻度。
3.1.2 准确吸取10mL样品溶液至100mL容量瓶中，加入5%乙酸5mL、水10mL，混匀后静置5min以沉淀蛋白。用水定容至刻度，混匀后过滤，弃去数mL初滤液后收集约30mL滤液。
3.1.3 将氨基固相萃取柱先用10mL甲醇、10mL水活化后，再将20mL样品滤液过滤，以1mL水清洗萃取柱，用0.25M，PH=3.5磷酸二氢钾溶液洗脱出5mL滤液。全部过程需要控制流速1滴/秒。
3.2 液相色谱参考条件
3.2.1 色谱柱：Water’s Symmetry C18 3.9×150mm。
3.2.2 柱温：25℃。
3.2.3 紫外检测器：检测波长254nm。
3.2.4 流动相：0.01M磷酸二氢钾：0.1M磷酸氢二钾=480：20 PH=5.0。
3.2.5 流速：0.6mL/min。
3.2.6 进样量：10μL。
3.2.7 色谱分析：量取10μL标准溶液及样品溶液注入色谱仪中，以保留时间定性，以试样峰高或峰面积与标准比较定量。
4. 结果
4.1 计算

式中：X－样品中核苷酸的含量，mg/g；
h1－样品峰高或峰面积；
C－标准溶液浓度，μg/mL；
K－稀释倍数；
h2－标准溶液峰高或峰面积；
m－试样量，g。
4.2 精密度和准确度
对本方法进行精密度和准确度试验，方法的回收率在83%~99%之间，相对相差≤6%。

来源:医药网-虎网医药-药械-资讯网 ( 责任编辑:sundy )

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