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反式白藜芦醇的测定方法（高效液相色谱法）

来源：- 浏览：86 更新时间：2011年12月02日

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本方法适用于葡萄酒以及其他植物和食品中反式白藜芦醇的测定。
本方法反式白藜芦醇的最低检出量为10ng/mL。
1. 方法提要
白藜芦醇（resveratrol, 3,4’,5-三羟基二苯乙烯）存在于葡萄、花生、桑葚等许多植物中，其中葡萄，尤其是葡萄皮中含量较高。目前葡萄酒中白藜芦醇的含正逐渐被作为评价酒品质的一个指标。
白藜芦醇有顺式和反式两种异构体（如下所示），在280、306nm分别有最高吸收值，植物中通常以较稳定的反式形式存在。HPLC测定葡萄酒中的白藜芦醇，酒样经前处理，用C18分析柱在306nm和280nm处分析，依据反式白藜芦醇标准在306nm处定量。

2. 试剂
（1）乙酸乙酯（CH3COOC2H5）、碳酸氢钠（NaHCO3）、无水硫酸钠（Na2SO4），以上为国产分析纯，乙腈（Fisher公司）为色谱纯，重蒸馏水。
（2）反式白藜芦醇标准品（Sigma公司，USA）。
（3）反式白藜芦醇标准储备液：准确称取5mg反式白藜芦醇标准品，用乙腈溶解后定容至10mL，混匀备用。此溶液每1mL含反式白藜芦醇0.5mg。
（4）反式白藜芦醇标准使用液：准确吸取标准储备液0.1mL，用乙腈定容至10mL，混匀备用。此溶液每1mL含反式白藜芦醇5μg。
3. 仪器
（1）高效液相色谱（HPLC）。
（2）旋转蒸发仪。
4. 测定步骤
（1）样品处理：取葡萄酒100mL，用50mL乙酸乙酯提取3次，收集提取液，用3%（体积分数）的NaHCO3溶液洗涤3次，重蒸馏水洗涤至溶液为中性，无水硫酸钠脱水，40℃下真空减压浓缩至干，残留物用5.0mL乙腈溶液，备用。
（2）色谱分离条件：
色谱柱：μ-Bondapak C-（300mm×3.9mm Waters公司出品）。
流动相：乙腈+水（40+60体积比）。
流速：0.60mL/min。
检测器波长：紫外光306nm和380nm。
柱温：室温。
进样量：20μL。
（3）标准曲线的绘制：以白藜芦醇不同浓度标准溶液进样，得到相应峰高值以浓度为横坐标，峰高为纵坐标绘制标准曲线，线性方程为y=57.69x－0.42（y：色谱峰高mm，x：白藜芦醇的浓度μg/mL)，相关系数（r）为0.9998。
（4）样品测定：准确吸取处理液和标准使用液各20μL注入高效色谱仪分离测定。根据反式白藜芦醇标准品峰的保留时间定性，根据其峰面积或峰高计算样品中反式白藜芦醇的含量。
5. 结果计算

式中 X——葡萄酒中反式白藜芦醇的含量（μg/100mL）；
c——标准的浓度（μg/mL）；
S1——样品峰面积或峰高；
S2——标准峰面积或峰高；
V——最终体积（mL）；
m——取样量（mL）。
6. 准确度与精密度
取中国红葡萄酒（北京龙徽葡萄酒公司）为样品，进行5次重复试验，其标准差为0.84，相对标准差（RSD）为3.5%。另取样品5份，分别加入20.0μg/100mL标样1.0mL，处理同前。其回收率在90.0%~97.8%之间，标准差为3.88，相对标准差（RSD）为3.1%。
7. 注释
（1）白藜芦醇具有以下主要功能：白藜芦醇能降低血脂，减少血小板的凝集，降低低密度脂蛋白的氧化，抑制环氧合酶与过氧化氢酶催化合成的产物诱导的癌症，1997年《Science》上将其列为预防和治疗癌症的最有前途的药物之一。
（2）白藜芦醇见光易分解，整个操作过程应避免阳光直射，并尽可能在暗室进行，并且应在葡萄酒开封后立刻测定，以免其中的白藜芦醇发生氧化或异构化。
（3）白藜芦醇在葡萄皮中含量较高，因而带皮发酵的红葡萄酒中含量高；仅以葡萄果汗发酵的白葡萄酒中含量低；采用葡萄原汁发酵的酒中含量高；而勾兑酒中含量微少。
（4）测定某品牌红葡萄酒中白藜芦醇，在306nm得到色谱图（图2-55）。根据标准的保留时间确定7.7min时出现反式白藜芦醇，紧随其后在8.9min时获得一个小峰。换至280nm、7.7min处的峰形变小，而8.9min处的峰形有显著增加（图2-56）。根据结构分析，顺式白藜芦醇的极性略小于反式白藜芦醇，在反相色谱中应在反式白藜芦醇的稍后出现，由此可以判断8.9min处为顺式白藜芦醇。

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