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胆甾醇的测定方法（高效液相色谱法）

来源：- 浏览：179 更新时间：2011年12月02日

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本方法适用于食品中胆甾醇的测定。
本方法最低检出量为93ng。
1. 方法提要
样品中胆甾醇用适当有机溶剂提取，得到胆甾醇和脂类物质的混合物，经皂化后除去脂类干扰物，再用适当的有机溶剂提取胆甾醇，高效液相色谱测定，与标准的保留时间比较定性，外标法定量。
2. 仪器
（1）高效液相色谱仪，二级管阵列检测器。
（2）电热恒温水浴。
（3）超声波提取器。
（4）Tubo Vap500浓缩仪（美国Zymark公司）。
3. 试剂
所使用试剂除特殊注明外，均为分析纯；实验用水为去离子水或同等纯度蒸馏水。
（1）氢氧化钾溶液（500g/L）：称取50g氢氧化钾，加水溶解并稀释至100mL。
（2）氯化钠溶液（50g/L）：称取5g氯化钠，加水溶解并稀释至100mL。
（3）胆甾醇标准溶液：准确称取5.0mg胆甾醇标准品，加优极甲醇溶解，并定容至10mL，混匀后置冰箱保存。此溶液每1mL含胆甾醇0.50mg。
（4）溶剂：甲醇，三氯甲烷，乙醚，乙腈，无水乙醇，石油醚。
（5）无水硫酸钠。
4. 测定步骤
（1）样品处理：
a. 固体样品：准确称取粉碎并混合均匀的样品5.0g置于250mL具塞锥形瓶中，加三氯甲烷+甲醇（2+1）混合液100mL，超声波提取45min，用快速滤纸过滤，滤纸及残渣用少量三氯甲烷+甲醇（2+1）混合液洗涤数次，收集滤液和洗液，置于250mL分液漏斗中，用30、30、20mL50g/L氯化钠溶液洗涤3次，弃氯化钠层。三氯甲烷提取液用无水硫酸钠脱水后，转移到Tubo Vap500浓缩仪低温快速浓缩至1.0mL左右，取出剩余液体置于100mL具塞比色管中，用少量三氯甲烷冲洗浓缩仪，合并洗液于100mL具塞比色管中。在60~65℃水浴上用氮气吹干，加入无水乙醇20mL，500g/L氢氧化钾溶液5mL，在60~65℃水浴上皂化45min，皂化时不断振摇；皂化完毕后，立即趁热取出塞子，稍冷后加入20mL 50g/L氯化钠溶液，混匀后加入30mL乙醚+甲醇（2+1）混合液，振摇提取5min，静置，小心取上清液20mL置于50mL分液漏斗中，加少量水多次洗涤提取液（至洗涤液为中性），提取液用无水硫酸钠脱水，水浴上挥干溶剂，用甲醇定容至1.0mL，混匀后取上清液供高效液相色谱分析。
b. 液体样品：准确吸取混合均匀的液体样品50.0mL，置于250mL分液漏斗中，加入浓氨水5.0mL，混匀，加入20mL无水乙醇再混匀，用乙醚+石油醚（1+1）混合液40，20，20mL提取3次，合并提取液，置于100mL具塞比色管中，以下按a项“在60~65℃水浴上用氮气吹干”起操作。
（2）色谱分离条件：
色谱柱：C18柱。
流动相：乙腈+甲醇（3+2）。
测定波长：205nm。
流速：1.5mL/min。
进样量：10μL。
（3）标准曲线：准确吸取标准溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0于10mL容量瓶中，用优级纯甲醇稀释至刻度，混匀后，分别取10.0μL注入高效液相色谱仪中，以外标法绘制标准曲线。标准曲线为0.20、0.40、0.60、0.80、1.0mg/mL。回归方程y=1085.22x－329.77，r=0.9999。
（4）样品测定：取供色谱分析的样品溶液10μL，注入高效液相色谱仪与标准品峰的保留时间比较定性，外标法定量。
胆甾醇标准曲线图见图2-39，胆甾醇标准品色谱图见图2-40，样品色谱图见图2-41。

名　　称	保留时间/min	面积	峰高	量	单位
1	12.413	2886360	161889	0.5	mg/ml

5. 结果计算

式中 X——样品中胆甾醇含量（μg/g或μg/mL）；
c——得出的测定样液中胆甾醇的浓度（μg/mL）；
V——样品皂化后胆甾醇提取液总体积（mL）；
V1——样品测定液总体积（mL）；
m——样品的质量（g）或体积（g或mL）。
6. 准确度与精密度
在不同样品中进行不同浓度的加标回收试验，胆甾醇回收率为89.2%~105.7%。重复10次测定结果的RSD为11.2%。
7. 注释
（1）甾醇（Sterol）是一类广泛存在于自然界的甾体化合物，是饱和或不饱和的仲醇。主要存在于动植物的脂肪中；或以较高级脂肪酸酯的形式存在于动物体内；或以苷的形式存在于植物组织中。来自动物体内的甾醇为动物甾醇如胆甾醇；来自植物的甾醇称为植物甾醇如谷甾醇。
（2）胆甾醇（Cholesterol）分子式为C27H46O，以醇式脂肪酸的形式存在于所有的动物细胞中，尤其是在脑和脊髓中最多。胆甾醇又称胆固醇。人体胆甾醇代谢作用发生障碍造成血液中胆甾醇含量过高，可导致动脉粥样硬化。但胆甾醇为人体合成维生素D的重要物质，人体内应保持一定量。
（3）胆甾醇具有旋光性，白色晶体，易溶于有机溶剂。
（4）本方法所用乙醚不得含有过氧化物。
（5）对于脂肪含量少的样品，可省略脂肪提取步骤，样品直接用氢氧化钾乙醇溶液皂化后再用有机溶剂提取胆甾醇即可。

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