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大豆异黄酮的测定

来源：- 浏览：227 更新时间：2011年12月02日

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● 含量：每片含大豆异黄酮应为表示量的90.0%—140.0%。
● 稀释溶液的制备：80%甲醇：加200ml高纯度去离子水到800ml色谱纯甲醇中（Fisher A452-4或其它同类的产品）。
● 流动相的制备：
流动相A：0.1%醋酸水溶液：即加4ml冰醋酸到4升高纯度去离子水中，混合均匀、除气。必要时使用前过滤。
流动相B：0.1%醋酸乙腈溶液：加4ml冰醋酸到4升新开封的色谱纯乙腈（Fisher 998—4或其它同类的产品）中，混合均匀、除气。必要时使用前过滤。
● 操作步骤：
标准品：
大豆异黄酮共有12个主要组分，9个为糖甙，3个是甙元（见附表1）。目前市售标准品只有LC实验室（LC Laboratoloris）提供的染料木甙、染料木素、大豆黄甙、大豆黄素、黄豆黄甙、黄豆黄素。其中3个是糖甙，3个是甙元。因此，其它6个糖甙（3个丙二酰异黄酮、3个乙酰异黄酮）标准品只能用分子量比值的方法计算出校正因子后，间接用于计算（这6种糖甙不久将可以从LC实验室买到）。因此，目前能使用的标准品只有6种。
● 标准品溶液的制备：
用5位数字的分析天平精密称取如下标准品，定量转移至50ml容量瓶中：

大豆黄甙 daidzin	100mg	黄豆黄甙 glycitin	25mg	染料木甙 genistin	100mg
大豆黄素 daidzein	10mg	黄豆黄素 glycitain	10mg	染料木素 genistein	10mg

用前述的稀释溶液V/V稀释到50ml，放入超声发生器中震荡直到溶解。
随后分别按1：50，2：50，3：50，4：50，5：50的比例稀释，制成标准品系列溶液，为绘制5点曲线作准备。
以上所配制的标准品溶液的浓度（mg/L）分别如下：

级别	大豆黄甙	黄豆黄甙	染料木甙	大豆黄素	黄豆黄素	染料木素
1：50	40	10	40	4	4	4
2：50	80	20	80	8	8	8
3：50	120	30	120	12	12	12
4：50	160	40	160	16	16	16
5：50	200	50	200	20	20	20

● 样品溶液制备：
精确称取20片样品，求得平均片重并用乳钵研磨成细粉。精密称取大约相当于25mg的大豆异黄酮（大约1870mg样品）的粉末并定量转移至50ml容量瓶中，加入大约30ml稀释溶液，并用稀释溶液冲洗瓶颈所附样品，将容量瓶置于超声波发生器中震荡大约10分钟后取出，冷却至室温，用稀释溶液定容。用带有13mm 0.45μm尼龙过滤器(Gelman P/N 4426或其它同类的产品)的10ml塑料注射器(B&D P/N309604或其它同类的产品)过滤溶液，开始的3ml过滤液弃去后，将其余溶液直接注入WISP小玻璃瓶中，制成样品的溶液。
● 色谱系统：（可用等同的系统代替）
Water HPLC 系统，带有Millennium色谱控制器
Water 600型HPLC泵
Water 996型紫外检测器
Water 717型自动进样器
● 色谱条件：
流速： 1.0ml/min
检测波长: 260nm
色谱柱: YMC—PACK ODS—AM 5μm，Spherical，250x3.0mm，120A Pore
防护柱（guard column）：
用十八烷基硅烷（ODS）填充的 Phenomenex Security Guard gartridge柱
柱温： 40℃
进样体积： 10μl
梯度洗脱：
用流动相A和B进行线性梯度洗脱。进样后起始流动相A：B为90：10（V/V），到60分钟样品测完时A：B是70：30（V/V）。随后用100%的B流动相洗涤柱子约10分钟，再用A：B（90：10）平衡10分钟后，第2次进样。
● 积分参数（（可适当调整至最优组合）：
峰宽：15
阈值：30
最小峰面积：1000
最小峰高度：10
● 系统适用性：
通过用上述HPLC条件分析样品，并和权威机构对所有12个大豆异黄酮标准品在HPLC图谱中位置的比较可确定系统的适用性。而12种异黄酮的洗脱次序是被色质连用系统（HPLC—MS）所确定过的（依次为：大豆黄甙、黄豆黄甙、染料木甙、丙二酰大豆黄甙、丙二酰黄豆黄甙、乙酰大豆黄甙、乙酰黄豆黄甙、丙二酰染料木甙、大豆黄素、黄豆黄素、乙酰染料木甙、染料木素）。（标准品和样品的色谱图见附件。）
若达到系统适应性标准，可将样品溶液重复进样并记录主峰面积。
● 大豆异黄酮含量计算
1）.丙二酰异黄酮和乙酰异黄酮的校正因子的计算：
用HPLC分别测定5种浓度的6个标准品，作出标准品曲线。如你的软件不能给出校正因子，标准品曲线的斜率是非常接近于校正因子的（假如截矩是零则斜率就等于校正因子）。三个糖甙，即大豆黄甙、黄豆黄甙和染料木甙的校正因子被用来计算其相应的丙二酰异黄酮和乙酰异黄酮的校正因子。
大豆异黄酮糖甙的分子量如下表：

糖　甙	糖甙分子量	乙酰糖甙分子量	丙二酰糖甙分子量
大豆黄甙	416	458	502
黄豆黄甙	446	488	532
染料木甙	432	474	518

在与相应糖甙比较时，每个乙酰或丙二酰糖甙的校正因子，依其分子量增加比例而增大。
2）.样品溶液中大豆异黄酮含量计算：
a. 样品溶液中丙二酰大豆黄甙、丙二酰染料木甙、丙二酰黄豆黄甙、乙酰大豆黄甙、乙酰黄豆黄甙、乙酰染料木甙的含量：
分别用样品溶液HPLC图谱中丙二酰大豆黄甙、丙二酰染料木甙、丙二酰黄豆黄甙、乙酰大豆黄甙、乙酰黄豆黄甙、乙酰染料木甙的峰面积÷相应的校正因子。
b. 样品溶液中染料木甙、染料木素、大豆黄甙、大豆黄素、黄豆黄甙、黄豆黄素的含量：以外标法计算。
样品溶液中总大豆异黄酮含量：为染料木甙、染料木素、大豆黄甙、大豆黄素、黄豆黄甙、黄豆黄素、丙二酰大豆黄甙、丙二酰染料木甙、丙二酰黄豆黄甙、乙酰大豆黄甙、乙酰黄豆黄甙、乙酰染料木甙的含量之和（a+b）。
说明：乙酰和丙二酰异黄酮的鉴定：有三种可能的方法：
1）.与市售的标准品比较：不久LC实验室将推出乙酰和丙二酰大豆黄酮标准品，到时就可用次方法来鉴定。
2）.色质连用（LC—MC）分析方法：在有标准品分析的条件之下，用色质连用系统来鉴定不同的异黄酮是非常准确可靠的，所有的样品都能质谱图上出现和M+H峰及其它特征峰。
3）.实验样品的图形比较：在没有市售标准品或没有色质连用条件时，用NovaSoyтм*公司的HPLC分析图（附有测定方法），对鉴定每个峰是有帮助的。请注意NovaSoyтм*通常含有非常低浓度的丙二酰异黄酮，但随样品来的图谱可做比较时参考。
*NovaSoyтм*美国最畅销的大豆异黄酮产品。

参考文献： Mark W，collison，ADM公司研究资料。

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