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薄层色谱法测定食品中牛磺酸

来源：- 浏览：558 更新时间：2011年12月02日

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牛磺酸又名牛胆酸或牛胆碱（Taurine），1827年作为牛胆汁的一个组成成分从动物组织中首次分离出来，由此而得名。游离牛磺酸的化学名为α-氨基乙基磺酸，是一种含硫β-氨基酸。
牛磺酸具有保肝利胆、抗惊厥、抗心律失常，调节渗透压、降血压、治疗动脉硬化等多种生理作用，尤其是对婴幼儿的脑、神经、内脏、视网膜、内分泌机能等的发育以及对钙、脂肪和维生素的吸收都具有十分重要的作用。目前，许多国家已把牛磺酸作为一种营养强化剂应用于食品。为了加强食品卫生监督，需要建立食品中牛磺酸的测定方法。考虑我国广大基层单位缺少氨基酸分析仪，我们研究了薄层层析法，本实验所用仪器和试剂都易于购置，是一个值得推广的方法。
1. 仪器与试剂
1.1 仪器 1.5cm×30cm层析柱；蒸发皿1.5cm×20cm薄层板；10μl微量注射器；展开槽；玻璃喷雾器；电吹风。
1.2 试剂以下试剂均为分析纯。盐酸；氢氧化钠；无水乙醇；正丙醇；冰乙醇；正丁醇；羧甲基纤维素；硅胶G（200目）；强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂[001×7（732）]；强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂[201×7（717）]。
1%茚三酮乙醇溶液：称取1g茚三酮，加乙醇至100ml。
牛磺酸标准溶液：精确称取牛磺酸标准品40mg，加水溶解并用水定容至100ml，即得含牛磺酸0.4g/L标准溶液。
展开剂：正丙醇－水－冰乙酸－乙醇（5.2+2+2+0.8）；正丁醇－水－冰乙酸（4+1+1）。
2. 测定步骤
2.1 离子交换柱的制备
2.1.1 阴离子交换柱：强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂，用乙醇浸泡过夜，再用水漂洗至水层无色。然后填1根1.5cm×10cm高的交换柱，装柱时不要混入气泡，30ml水洗至流出液为中性，然后10ml 1mol/L NaOH过柱，将交换柱处理为强碱性OH-型备用。
2.1.2 二元离子交换柱：先装填1.5cm×8cm漂洗过的阴离子交换树脂，然后再装入1.5cm×8cm的阳离子交换树脂（装前后乙醇浸泡过夜，再用水漂洗至水无色），再加30ml水洗至流出液为中性。
2.2 样品处理
2.2.1 饮料：吸取5.0ml样品通过阴离子交换柱，调流速为30滴/min，待液面降至树脂顶端时，加入水25.0ml洗脱，再加25.0ml 2%HC1洗脱，以上流出液均弃去，最后加入25.0ml 2%HC1洗脱，用蒸发皿接收洗脱液，于100℃水浴挥干，加水5.0ml，充分溶解残渣，过滤，滤液作薄层分析用。
使用过的交换柱，用50ml水快速洗至中性后再用。
2.2.2 谷类食品：称取2.0g已粉碎均匀的样品于25ml具塞量筒中；分别用25、10、10ml水提取3次，每次提取静置15min后，用吸管将上清液转入二元柱，调流速为30滴/min，待流至树脂顶端时，加50ml水淋洗柱子，如果吸取上清液时吸入不溶物使二元柱堵塞，可用长玻棒伸入柱内轻轻搅动。接收全部流出液，将其倒入阴离子交换柱，以下操作除挥干后准确加入2.0ml水溶解残渣外，其余与“2.2.1“饮料项相同。已用过的两根交换柱弃去重填。
2.2.3 奶粉：称取2.0g均匀样品于烧杯中，加入10.0ml水，加热2min溶解（勿使其沸腾），冷却后，倒入二元柱，再用5ml水洗烧杯，洗液亦转入二元柱，调流速为30滴/min，待流至树脂顶端时，加50ml水洗脱。接收全部洗脱液，将其倒入阴离子交换柱，调流速为30滴/min，待流至树脂顶端时，加75ml水、252ml2%HC1洗脱，弃去洗脱液。最后用25ml 2%HC1洗脱，接收全部洗脱液，于水浴挥干后准确加入2.0ml水，充分溶解残渣，弃去洗脱液。最后用25ml 2%HC1洗脱，接收全部洗脱液，于水浴挥干后准确加入2.0ml水，充分溶解残渣，静置后过滤，滤液备作薄层分析用。
2.3 薄层层析
2.3.1 薄层板的制备：称取15g硅胶G，加45ml0.3%羧甲基纤维素钠，铺成0.25mm厚的5cm×20cm薄层板，室温晾干后，于（105±5）℃活化1h后取出，干燥器中保存备用。
2.3.2 占样：在薄层板下端2cm处，用微量注射器点2μl样品溶液，同时点1μl、2μl牛磺酸标准溶液（相当于牛磺酸0.4μg、0.8μg），各点间距1cm。
2.3.3 展开与显色：①饮料及谷类食品：将点好的薄层板放入盛有展开剂展开槽中，展开至12cm（约90min），取出薄层板，晾干。喷显色剂后，于80℃烘箱中烘烤5min，斑点呈粉红至紫红色。根据样品点和标准点的比移值定性，根据斑点大小及颜色深浅进行半定量。②奶粉：奶粉类食品须展开两次，第一次展开16cm（约2h），取出晾干后，再放入展开槽，展开16cm，其余操作同①。
2.4 计算

式中：X－样品中牛磺酸的含量，g/kg或g/L；A－样品斑点相当于牛磺酸的质量，μg；
V1－水浴挥干后加入水的体积，ml；V2－点样体积，μl；m－样品质量或体积，g或ml。
3. 结果与讨论
3.1 操作步骤的评价
3.1.1 提取：牛磺酸为游离状态，易溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚，可用水直接提取，勿须水解。
3.1.2 阴离子交换柱净化；牛磺酸虽为两性离子，但在强酸性条件下，不能吸附于阳离子交换树脂上，说明与阳离子交换性很弱。OH-型阴离子交换柱能够吸附牛磺酸，可用水洗去杂质，水洗体积25~75ml不影响牛磺酸的吸附，可视除去杂质的情况而定。之后用酸将牛磺酸洗下。
3.1.3 二元交换柱净化：中性条件下，牛磺酸不保留于二元柱上，但二元柱能够保留其它氨基酸。谷类、奶粉类食品含有氨基酸，能与茚三酮显色剂显色，影响层析效果，因此须经二元柱净化。
3.1.4 展开：由于水浴挥干的程度不同，因此点样液的pH值不等，但经试验，pH并不影响牛磺酸的Rf值。奶粉因其干扰层析的成分较多，所以展开两次，可分开干扰物。
3.2 干扰实验及展开剂的选择
3.2.1 将含有苯丙氯酸、磺基丙氨酸、半胱氨酸、谷酰氨、蛋白糖、牛磺酸、精氨酸、糖精、环己基氨基磺酸的样品（含量各为0.8g/L）通过二元柱、阴离子交换柱净化后，水浴挥干，结果只有牛磺酸一个显色斑点。说明这些干扰物均不干扰层析。
3.2.2 展开剂的选择：当展开剂为正丙醇+水（1+1）时，苯丙氨酸（Rf=0.664）、磺基丙氨酸（Rf=0.684）干扰牛磺酸的薄层层析，牛磺酸的Rf为0.646；当展开剂改为正丙醇+冰醋酸+水+乙醇（5.2+2+2+0.8）时，牛磺酸的R f值为0.37，与其它两种氨基酚分开。从表1中可以看出5号分离较好。
表1 正丙醇：乙酸：水：乙醇系统

序号	比　例	rf值	结　果
牛磺酸	苯丙氨酸	磺基丙氨酸
1	2.5:2.5:2.5:1	0.51	0.64	0.45	磺基丙氨酸拖尾
2	3.5:2.5:2.5:1	0.54	0.64	0.39	磺基丙氨酸拖尾
3	4.5:2.5:2.5:1	0.43	0.64	0.38	磺基丙氨酸与年磺酸拖尾
4	5.5:2.5:2.5:1	0.40	0.54	0.25	均不拖尾
5	6.5:2.5:2.5:1	0.37	0.58	0.25	均不拖尾

3.3 最低检出量和最低检出限肉眼可辨最低检出量为0.20μg，最低检出浓度为0.08g/L（kg）。
3.4 加标回收率选择不含牛磺酸的饮料、奶粉、代乳粉，分别加入0.2g/L（kg）的牛磺酸，依法操作，分别测定8次，结果见表2。
表2 饮料、代乳粉、奶粉中牛磺酸加标目测回收率

食品类	添加量（g/kg）	平均回收率（%）
饮料	0.4	98
0.2	97
代乳粉	0.4	95
0.2	95
0.2	93
奶粉	0.8	93
0.4	92
0.2	93

3.5 样品中牛磺酸的测定在北京市场上采集了少量饮料、代乳粉、奶粉、并依法测定。结果见表3。
表3 样品中牛磺酸的含量调查表

食品类	样品名称	牛磺酸浓度[g/kg（l）]
饮料	力保健	8.0
红牛饮料	5.3
代乳粉	第1步婴儿全价营养食品	0.28
全营养分儿粉	0.09
奶粉	北大荒ad全脂奶粉	未检出
完达山牌婴儿配方奶粉	0.30
金星婴儿奶粉	0.16

本方法简便、快速，所用仪器和试剂简单，此目测半定量测定方法的回收率高、可测浓度范围宽，能测多种类型食品，适用于基层卫生部门进行牛磺酸营养强化剂的检测。

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