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叶酸的测定方法（微生物测定法）

来源：- 浏览：354 更新时间：2011年12月02日

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叶酸是一种重要的B族维生素，其结构是由一个蝶啶与一个对氨基苯甲酸给合成蝶酸，再与一个或多个谷氨酸结合而成，其化学名称为蝶酰谷氨酸（pteroylglutamate，pteGlu）。通常意义上，叶酸指的是一组具有蝶酰谷氨酸结构和相关生活性的同效维生素。它的英文名称包括folic acid,foalte,folates,folacin，一般可以互用。
叶酸外观为淡黄色结晶粉末，微溶于水，其钠盐易于溶解。不溶于乙醇、乙醚等有机溶剂。叶酸对热、光敏感，在酸性条件下不稳定，在碱性和中性溶液中对热敏感。
叶酸的测定方法主要有微生物法、HPLC法、荧光法和放射免疫法等。后几种方法因快速等优点受到青睐，尤其是HPLC法近年来发展迅速。但是由于叶酸衍生物繁多，标准品来源有限－各种衍生物需从不同化学公司或实验室购买，有的甚至需要自行合成；食品中存在多种干扰因素等问题，使分析方法的使用受到限制。微生物法是测定叶酸的经典方法，目前美、英、日等国家仍采用此法用于测定食物成分中叶酸含量。微生物法所选用的菌种可利用培养基中叶酸单谷氨酸或双谷氨酸盐进行生长，灵敏度较高，但是检测需要的时间较长。天然食物中大部分叶酸为多谷氨酸盐，所以在测定之前，需用轭合酶（conjugase）对叶酸进行水解。叶酸的结构式如下系列：

1. 原理
叶酸是酪乳酸杆菌（Lactobacillus casei，L.C，ATCC 7469简称L.C）生长所必需的营养素。在一定条件下，L.C的生长繁殖与培养基中叶酸含量呈正比关系，细菌增殖的量以光密度值计，通过与标准曲线相比较，计算出样品中叶酸的含量。
2. 适用范围
参考Methods of Vitamin Assay，第四版。本方法适用于各类食物中叶酸的测定。检测限为0.1ng。
3. 仪器与设备
（1）恒温培养箱。
（2）离心机。
（3）高压消毒锅。
（4）振荡器。
（5）接种针和接种环。
（6）分光光度计。
4. 试剂
除特殊说明外，本实验中所有试剂均为分析纯，水为蒸馏水。
（1）菌种：酪乳酸杆菌（Lactobacillus casei，L.C，ATCC 7469）。
（2）磷酸缓冲液（0.05mol/L，pH6.8）：称取4.35g Na3PO4·12H2O，10.39g Na2HPO4·7H2O溶解于800mL水中。临用前用约5g抗坏血酸调节pH至6.8 [注意：叶酸对光、热敏感，易被氧化破坏，抗坏血酸有助于保护叶酸被氧化]。
（3）鸡胰酶溶液：称取100mg干燥的鸡胰酶（Difco公司）[注意：含有叶酸轭合酶，用于水解叶酸多谷氨酸盐]，加入20mL磷酸缓冲液制成匀浆，3000r/min离心10min，取清液备用。临用前现配。
（4）蛋白酶－淀粉酶溶液：分别称取200mg蛋白酶（Sigma公司）和淀粉酶（Sigma公司），加入20mL磷酸缓冲液制成匀浆，离心3000r/min 10min，取上清液备用。临用前配制。
（5）2＋8乙醇溶液：量取20mL无水乙醇溶液，加入80mL水混匀。
（6）0.01mol/L NaOH：称取0.4g氢氧化钠，加2＋8乙醇溶液溶解并稀释至1L。
（7）10mol/L NaOH：称取400g氢氧化钠，加水溶解并稀释至1L。
（8）叶酸标准贮备液（200μg/mL）：准确称取200mg叶酸标准品（Sigma公司，纯度大于98％），用0.01mol/L NaOH溶解并定容至1L。贮存于棕色瓶中。
（9）叶酸标准中间液（200ng/mL）：准确吸取1.0mL叶酸标准贮备液，用0.01mol/L NaOH溶解并定容至1L。贮存于棕色瓶中。待标定。标定：准确吸取1mL叶酸标准贮备液，用0.1mol/L NaOH定容至25mL。以0.1mol/L NaOH调零点，比色杯厚度1cm，波长256nm，测定3次紫外吸光度值，取平均值，按下式计算标准中间液浓度。

式中 ρ——叶酸标准贮备液浓度，μg/mL；
A——标准液平均紫外吸光度值；
E——摩尔消光系数24，500；
Mr——叶酸相对分子质量441.42；
25——测定紫外吸光度值时的稀释倍数；
103——由g/L换算成μg/mL的换算系数。
（10）叶酸标准工作液（0.2ng/mL）：准确吸取1.0mL叶酸标准中间液，用磷酸缓冲液稀释定容至1L。
（11）2.4mol/L HCl：量取20mL浓盐酸，加水稀释至100mL。
（12）酶解酪蛋白溶液：将8g碳酸氢钠溶解于1L水中，加入60g去维生素酪蛋白（Sigma公司），用10mol/L NaOH调节pH至8.0[注意：调pH时应小心，不要过碱后再加酸反复调节，避免酪蛋白结块]。加入300mg胰酶，搅拌20min，使胰酶混匀充分。再加入2.5mL甲苯，置37℃恒温箱酶解48～72h[注意：此步骤是将酪蛋白酶解为L.C可以利用的小分子肽。酶解时间不易超过72h，如时间过长，配成的培养基不利于细菌生长]。将酪蛋白液从恒温箱中提出，121℃高压30min以终止反应并去除甲苯。冷却，加10g硅藻土搅拌，用垫有滤纸的布氏漏斗过滤。向滤液中加入约60mL冰乙酸调节pH至3.7。称取活性炭12g，加入滤液中搅拌10min，用布氏漏斗过滤，重复3次。每次过滤时，布氏漏斗内加有10g硅藻土协助过滤。最后滤液用水稀释至1200mL，4℃冰箱保存1年[注意：活性炭可吸附酪蛋白中的叶酸以减少试剂空白，同时也可吸附肽及氨基酸，应注意控制搅拌时间]。取10mL酶解后的酪蛋白溶液加入已称重的蒸发皿中，沸水浴蒸发至干。将蒸发皿置于100℃恒温烤箱内干燥至恒重，在干燥器中冷却至室温。称量蒸发皿的质量，蒸发皿内固体重量，如固体质量小于400mg，即每毫升酪蛋白溶液中固体含量＜40mg，则弃除酪蛋白液，重新制备。
（13）黄嘌呤溶液：取0.4g黄嘌呤，加入10mL氨水，加热溶解，用水稀释至100mL。冰箱保存。
（14）腺嘌呤－鸟嘌呤－尿嘧啶：分别称取硫酸腺嘌呤，盐酸鸟嘌呤和尿嘧啶各0.2g，加入2.4mol/L HCl溶液10mL，加热溶解，用水稀释至100mL，室温贮存。
（15）乙酸缓冲液（1.7mol/L，pH4.5）：38.65g无水乙酸钠，19.8mL冰乙酸，加水稀释至500mL。
（16）维生素溶液：取10mg核黄素溶解于40mL乙酸缓冲液中。取0.2mg生物素、2.5mg NaHCO3、20mg对氨基苯甲酸、40mg盐酸吡多醇、4mg盐酸硫胺素、8mg泛酸钙、8mg烟酸溶解于50mL水中。将上述两种溶液混合，加水至100mL。
（17）吐温－80溶解：将2g吐温－80加入100mL 45℃水中，混匀。
（18）还原型谷胱甘肽溶液：取0.1g还原型谷胱甘肽，加水至100mL。
（19）甲盐溶液：称取5g磷酸氢二钾和2g磷酸二氢钾，加水溶解至100mL，液面上加入少许甲苯保存。
（20）乙盐溶液：称取2g硫酸镁，0.5g硫酸亚铁和0.5g硫酸锰，加水至100mL；液面上加少许甲苯保存。
（21）基础培养基：按下表配制，最终定容至500mL。

酶解酪蛋白	100ml	l－盐酸半胱氨酸	0.2g
腺嘌呤－鸟嘌呤－尿嘧啶	2.5ml	色氨酸	0.2g
黄嘌呤溶液	2.5ml	还原型谷胱甘肽溶液	2.5ml
维生素溶液	5ml	葡萄糖	20g
吐温－80溶液	2.5ml	乙酸钠	20g
l－天冬氨酸	0.3g	甲盐溶液	2.5ml

加水至250mL，搅拌，用10mol/L NaOH溶液调节pH6.8±0.1，然后加入乙盐溶液2.5mL，磷酸缓冲液200mL，用水补至500mL。4℃冰箱内可保存一周[注意：甲、乙混合后易产生沉淀，所以配培养基时不可同时加入，加入甲盐后先调节pH再加入乙盐。基础培养基也可直接选购DIFCO公司生产的叶酸测定用培养基]。

葡萄糖	1g	甲盐溶液	0.2ml
蛋白胨	0.8g	乙盐溶液	0.2ml
酵母提取物干粉	0.2g	琼脂	1.2g
乙酸钠（naac·3h₂o）	1.7g

加水至100mL，置水浴煮至琼脂完全熔化，调节pH6.8±0.1。尽快倒入试管中，每管3～5mL，塞上棉塞，121℃高压灭菌15min，取出后直立试管，冷却至室温。于冰箱内保存。
5. 菌种制备保存
（1）贮备菌种的制备：将L.C纯菌种转接至2个或多个琼脂培养基管中。（37±0.5）℃恒温培养箱中培养16～24h。贮于冰箱内，每周转种一次留作贮备菌种。
（2）种子培养液的制备：取2mL叶酸标准使用液和10mL基础培养基，混匀，分装至4支5mL离心管中，塞上棉塞，121℃高压灭菌15min，实验时现制。
6. 操作步骤
所有操作均避光进行。
（1）样品制备：
① 强化剂型样品：称取0.1～0.5g样品（约含叶酸100～300ng）于100mL锥形瓶中，加入50mL磷酸缓冲液，混匀。121℃高压水解15min。定容至100mL，过滤。
② 果蔬类：称取样品0.2～2g（约含叶酸100～300ng），加磷酸缓冲液经高压水解后过滤，残渣用同样缓冲液再次高压，过滤。合并两次滤液，定容至100mL。
③ 谷、肉、蛋、鱼、豆、奶类等富含淀粉和/或蛋白类样品：称取样品0.1～2g（约含叶酸100～300ng），加磷酸缓冲液高压水解后，冷却。加入1mL鸡胰酶和1mL蛋白酶－淀粉酶液、1mL甲苯，充分混合，置于（37±0.5）℃恒温箱内酶解16～20h。酶解后定容至100mL过滤。另取一支试管，加入1mL鸡胰酶，1mL蛋白酶-淀粉酶和磷酸缓冲液，作酶空白。
④ 口服液、饮料、果汁等样品：称取样品0.5～2mL（约含叶酸100～300ng），加磷酸缓冲液高压水解后，冷却，加入1mL鸡胰酶，1mL甲苯，充分混合，置于（37±0.5）℃恒温箱内酶解16～20h。酶解后定容至100mL，过滤。另取一支试管，加入1mL鸡胰酶和磷酸缓冲液，作酶空白。
（2）根据样品叶酸含量，将上述滤液用磷酸缓冲液稀释到一定倍数，使叶酸终浓度为0.1～0.4ng/mL。
（3）样品管的制备：取4支试管，每支试管中分别加入稀释后样品液1.0、2.0、3.0、4.0mL，补充水至体积为5.0mL，加入5mL基础培养基，混匀。同样制作酶空白管。
（4）灭菌：将以上标准系列管、样品管和酶空白管全部塞上棉塞，121℃高压灭菌15min。
（5）标准系列管的制备：取试管分别加入叶酸标准工作液0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，相当于叶酸含量0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ng，加水补至体积为5.0mL，再加5mL基础培养基，混匀。如样品管一样进行灭菌。标准系列管进行平行测定。
（6）接种：
① 接种液的制备：接种前一天，用灭菌的接种针将菌种由贮备菌种管中转种至2支已灭菌的种子培养液中，（37±0.5）℃恒温培养箱中培养16～24h。混悬种子培养液，无菌操作下用接种针管将20滴种子培养液转移至另2支无菌的种子培养液中，（37±0.5）℃再培养6h。振荡混匀，制成菌种混悬液。立即使用[注意：叶酸是酪乳酸杆菌生长所必需的，但是如果培养基中叶酸含量过高，细菌可在体内贮存，使测定空白值，影响细菌生长曲线。将接种液转种再培养6h，有利于消耗细菌体内贮存的叶酸]。
② 接种：在无菌操作条件下向每支已灭菌的标准系列管、样品管和酶空白管接种一滴上述接种液[注意：应直接滴在培养基内]，混匀。留一支标准0管不接种，用于测定光密度时调零。
（7）培养：置于（37±0.5）℃恒温培养箱中培养20～40h。
（8）测定：用分光光度计，在波长540nm下，以未接种的标准0管调节零点，测定标准管、样品管和酶空白管的光密度值。
7. 计算
（1）绘制标准曲线：以标准系列管中叶酸含量为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制叶酸标准曲线。
（2）计算：根据样品管和酶空白管的光密度值，从标准曲线上查得相应的叶酸含量，按下式计算。

式中 x——样品中叶酸含量，μg/100g；
m1——从标准曲线上查得样品测定管中叶酸含量，ng；
m2——从标准曲线上查得酶空白管中叶酸含量，ng；
V1——样品制备时定容体积，mL；
f——稀释倍数；
V2——制备样品测定管时加入的样品液体积，mL；
m——样品质量，g；
10/1000——样品含量由ng/g换算成μg/100g的系数。
8. 注意事项
（1）同一实验室平行测定或重复测定结果相对偏差绝对值＜10％。
（2）微生物法的测定结果为总叶酸含量。
（3）微生物法测定叶酸常用的菌种除酪乳酸杆菌外还有粪链球菌（Strepto-coccus faecalis，S.F.ATCC 8043）。用酪乳酸杆菌测定灵敏度高，用粪链球菌测定重现性好。本方法选用酪乳酸杆菌，实验条件以适宜酪乳酸杆菌的生长条件而定。
（4）常用的酪蛋白处理方法有酶水解法、酸水解法和碱水解法，由于叶酸在碱性条件下相对稳定，所以用碱处理酪蛋白不能完全破坏叶酸，使培养基中叶酸含量偏高，标准空白值高，线性差。酸水解法和酶水解法均可有效去除叶酸，降解蛋白，使细菌生长曲线在0～1ng范围内线性良好，其中实验证明酶水解法更好。
（5）培养基的pH对细菌生长很重要，pH6.8～7.2，生长曲线最佳。pH过低或过高均不利于细菌生长。
（6）本方法配制的培养基和Difico公司的叶酸培养基比较，标准曲线线性基本一致，对样品检测结果基本一致。
（7）食物中叶酸多以多谷氨酸盐形式存在，而酪乳酸杆菌只能利用叶酸单、双、三谷氨酸盐，所以对天然食品处理时先用轭合酶对叶酸进行降解。常用的轭合酶来源有血浆、鸡胰酶和猪肾酶。猪肾酶需从市售猪肾中提取，操作复杂，提取后对酶的鉴定相对困难，且重复性差，酶的用量难于控制。鸡胰酶可从Difco公司购买，可直接使用，重复性好。鸡胰酶的用量与叶酸测定结果相关，以往报告中认为水解200ng叶酸需加入0.1～1mg鸡胰酶。也有人认为在pH7.0的环境下增加酶的用量可提高叶酸水解率。本实验室认为水解200ng叶酸，鸡胰酶用量宜控制在3～5mg左右，过高可降低水解效果。
（8）轭合酶在应用中也有其局限性。天然食物中往往也含有轭合酶，在食物贮藏、运输过程中叶酸衍生物之间可发生相互转化，使外源性轭合酶作用下降；并且蔬菜水果存在一些酶的干扰物质也影响酶的活性，如柠檬酸、鞣酸等。所以测定中样品需注意保鲜，及时测定；样品处理方法也应视样品性质而定。
（9）蛋白酶、淀粉酶的应用可将包裹于蛋白、淀粉之间或蛋白结合的叶酸释放，有助于样品检测。蛋白酶、淀粉酶、鸡胰酶联合应用，水解效力大于3酶效力之和。

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