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维生素C（抗坏血酸）的测定方法

来源：- 浏览：990 更新时间：2011年12月02日

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抗坏血酸溶于水，稍溶于丙酮与低级醇类，结晶抗坏血酸稳定，水溶液易氧化，遇空气中氧、热、光、碱性物质，特别是在有氧化酶及痕量酮、铁等重金属离子存在，可促进其氧化破坏进程。酸性、冷藏、隔氧，可延缓食品中抗坏血酸破坏。
国内外用于食物中维生素C含量测定的主要方法有三种，即2，6－二氯酚靛酚滴定法、2，4－二硝基苯肼法和荧光法。2，6－二氯酚靛酚滴定法只能测定食物中还原型抗坏血酸。由于脱氢型抗坏血酸在人体内与还原型坏血酸具有同样的生理功能。在一般情况下，测定食物中总抗坏血酸。2，4－二硝基苯肼法和荧光法都是测定食物中总抗坏血酸含量的方法。2，4－二硝基苯肼法是比色法，易受杂质干扰，灵敏度较低，而荧光法的灵敏度高于比色法2～3个数量级。另外，2，4－二硝基苯肼法采用85％的浓硫酸作溶剂，实验时不易操作。荧光法利用硼酸对脱氢抗坏血酸的掩蔽作用可测出杂质的荧光值，从而提高方法的专一性。因此，荧光法具有灵敏度较高，选择性好，易于操作等优点，但此方法易受仪器条件的限制。所以国标方法中选用荧光法为测定食物中维生素C含量的第一标准方法，而将2，4－二硝基苯肼法作为第二法。

一、荧光法

1. 原理
样品中还原型坏血酸经活性炭氧化成脱氢型抗坏血酸后，与邻苯二胺（OPOA）反应生成具有荧光的喹喔啉（quinoxaline），其荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一起条件下成正比，以此测定食物中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。

脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与OPDA反应，以此排除样品中荧光杂质所产生的干扰。本方法的最小检出限为0.022g/mL。
2. 适用范围
根据 GB12392—90进行检测，本方法适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定。
3. 仪器
（1）实验室常用设备。
（2）荧光分光光度计或具有350nm及430nm波长的荧光计。
（3）打碎机。
4. 试剂
本实验用水均为蒸馏水，试剂不加说明均为分析纯试剂。
（1）偏磷酸－乙酸液：称取15g偏磷酸，加入40mL冰乙酸及250mL水，搅拌，放置过夜使之逐渐溶解，加水至500mL。4℃冰箱可保存7～10d。
（2） 0.15mol/L H2SO4：取10mL硫酸，小心加入水中，再加水稀释至1200mL。
（3）偏磷酸－乙酸－硫酸液：以0.15mol/L硫酸液为稀释液，其余同偏磷酸－乙酸液配制。
（4）50％乙酸钠溶液：称取500g乙酸钠（CH3CO ONa·3H2O），加水至1000mL。
（5）硼酸－乙酸钠溶液：称取3g硼酸，溶于100mL乙酸钠溶液中。临用前配制。
（6）邻苯二胺溶液：称取20mg邻苯二胺，于临用前用水稀释至100mL。
（7）0.04％百里酚蓝指示剂溶液：称取0.1g百里酚蓝，加0.02mol/L氢氧化钠溶液，在玻璃研钵中研磨至溶解，氢氧化钠的用量约为10.75mL，磨溶后用水稀释至250mL。
变色范围：pH＝1.2　红色　
　　　　　　　　　 pH＝2.8　黄色　
　　　　　　　　 pH＞4.0　蓝色　

（8）活性炭的活化：加200g炭粉于1L 1＋9盐酸中，加热回流1～2，过滤，用水洗至滤液中无铁离子为止，置于110～120℃烘箱中干燥，备用。
（9）标准液：
① 抗坏血酸标准溶液（1mg/mL）：准确称取50mg抗坏血酸，用偏磷酸－乙酸液溶于50mL容量瓶中，并稀释至刻度。
② 抗坏血酸标准使用液（100μg/mL）：取10mL抗坏血酸标准液，用偏磷酸－乙酸溶液稀释至100mL。定容前试pH，如其pH＞2.2时，则应用溶液偏磷酸－乙酸－硫酸液稀释。
③ 标准曲线的制备：取下述“标准”溶液（抗坏血酸含量10μg/mL）0.5、1.0、1.5mL和2.0mL标准系列，取双份分别置于10mL带盖试管中，再用水补充至2.0mL。
5. 操作步骤
全部实验过程应避光。
（1）样品制备：称取100g鲜样，加100g偏磷酸－乙酸溶剂，倒入打碎机内打成匀浆，用百里酚蓝指示剂调试匀浆酸碱度。如呈红色，即可用偏磷酸－乙酸溶液稀释，若呈黄色或蓝色，则用偏磷酸－乙酸－硫酸溶液稀释，使其pH为1.2。匀浆的取量需根据样品中抗坏血酸的含量而定。当样品液含量在40～100μg/mL之间，一般取20g匀浆，用偏磷酸－乙酸溶液稀释至100mL，过滤，滤液备用。
（2）氧化处理：分别取样品滤液及标准使用液各100mL于带盖三角瓶中，加2g活性炭，用力振摇1min，过滤，弃去最初数毫升滤液，分别收集其余全部滤液，即样品氧化液和标准氧化液，待测定。
（3）各取5mL标准氧化液于2个50mL容量瓶中，分别标明“标准”及“标准空白”。
（4）各取5mL样品氧化液于2个50mL容量瓶中，分别标明“样品”及“样品空白“。
（5）于“标准空白”及“样品空白”溶液中备加5mL硼酸－乙酸钠溶液，混合摇动15min，用水稀释至50mL，在4℃冰箱中放置2h，取出备用。
（6）于“样品”及“标准”溶液中各加入5mL 50％乙酸钠溶液，用水稀释至50mL，备用。
（7）荧光反应：取“标准空白”溶液，“样品空白”溶液及（6）中“样品”溶液各2mL，分别置于10mL带盖试管中。在暗室中迅速向各管中加入5mL邻苯二胺，振摇混合，在室温下反应35min，用激发光波长338nm、发射光波长420nm测定荧光强度。标准系列荧光强度分别减去标准空白荧光强度为纵坐标，对应的抗坏血酸含量为横坐标，绘制标准曲线或进行相关计算，其直线回归方程供计算时使用。
6. 计算

式中 x——样品中抗坏血酸及脱氢抗坏血酸总含量，mg/100g；
ρ——由标准曲线查得或由回归方程算得样品溶液浓度，μg/mL；
m——试样质量，g；
f——样品溶液的稀释倍数；
V——荧光反应所用试样体积，mL。
7. 举例
测定每一制备溶液的荧光强度。用标准溶液每1mL含2.5、5.0、7.5μg及10.0μg，各标准浓度管读数减去相应的标准空白读数的各平均值做标准曲线。
由样品液读数减去样品液空白读数之值，从标准曲线上查得相应的抗坏血酸（μg/mL），按取样量及稀释率计算样品中抗坏血酸的含量。
如：取制备好的辣椒样品2.138g，稀释到100mL，氧化后分别取10mL滤液稀释到50mL，样品读数为23.34，样品空白读数为3.188，样品读数减去样品空白读为20.152，查荧光标准曲线相当标准抗坏血酸的2.23μg。

8. 注意事项
（1）大多数植物组织内含有一种能破坏抗坏血酸的氧化酶，因此，抗坏血酸的测定应采用新鲜样品并尽快用偏磷酸－醋酸提取液将样品制成匀浆以保存维生素C。
（2）某些果胶含量高的样品不易过滤，可采用抽滤的方法，也可先离心，再取上清液过滤。
（3）活性炭可将抗坏血酸氧化为脱氢抗坏血酸，但它也有吸附抗坏血酸的作用，故活性炭用量应适当与准确，所以，应用天平称量。我们的实验结果证明，用2g活性炭能使测定样品中还原型抗坏血酸完全氧化为脱氢型，其吸附影响不明显。

二、2，4－二硝基苯肼法

1. 原理
总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸。样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸，再与2，4－二硝基苯肼作用生成红氏脎，脎的含量与总抗坏血酸含量成正比，进行比色测定。
2. 适用范围
根据GB 12392—90进行检测。本方法适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定。
3. 仪器
（1）恒温箱：（37±0.5）℃。
（2）可见－紫外分光光度计
（3）打碎机。
4. 试剂
本实验用水均为蒸馏水，试剂纯度均为分析纯。
（1）4.5mol/L H2SO4：谨慎地加250mL硫酸（相对密度1.84）于700mL水中，冷却后用水稀释至1000mL。
（2）85％ H2SO4：谨慎地加900mL硫酸（相对密度1.84）于100mL水中。
（3）2％，2，4－二硝基苯肼溶液：溶解2g，2，4－二硝基苯肼于100mL4.5mol/L H2SO4内，过滤。不用时存于冰箱中，每次用前必须过滤。
（4）2％ H2C2O4溶液：溶解20g草酸于700mL水中，稀释至1000mL。
（5）1％ H2C2O4溶液：稀释500mL 2％草酸溶液至100mL。
（6）1％硫脲溶液：溶解5g硫脲于500mL 1％草酸溶液中。
（7）2％硫脲溶液：溶解10g硫脲于500mL 1％草酸溶液中。
（8）1mol/L盐酸：取100mL盐酸，加入水中，并稀释至1200mL。
（9）活性炭：将100g活性炭加到750mL 1mol/L盐酸中，回流1～2h，过滤，用水洗数次，至滤液中无铁离子（Fe3＋）为止，然后置于110℃烘箱中烘干。
（10）标准液：
① 抗坏血酸标准溶液（1mg/mL）：溶解100mg纯抗坏血酸于100mL 1％草酸溶液中。
② 标准曲线绘制：加1g活性炭于50mL标准溶液中，摇动1min，过滤。取10mL滤液放入500mL容量瓶中，加5.0g硫脲，用1％草酸溶液稀释至刻度。抗坏血酸浓度为2μg/mL。取5、10、20、25、40、50、60mL稀释液，分别放入7个100mL容量瓶中，用1％硫脲溶液稀释至刻度，使最后稀释液中抗坏血酸的浓度分别为1、2、4、5、8、10、12μg/mL。
按样品测定步骤形成脎并比色。
以吸光值为纵坐标，以抗坏血酸浓度（μg/mL）为横坐标绘制标准曲线。
5. 操作步骤
全部实验过程应避光。
（1）样品制备：
① 鲜样制备：称100g鲜样和100g 2％草酸溶液，倒入打碎机中打成匀浆，取10～40g匀浆（含1～2mg抗坏血酸）倒入100mL容量瓶中，用1％草酸溶液稀释至刻度，混匀。
② 干样制备：称1～4g干样（含1～2mg抗坏血酸）放入乳钵内，加入1％草酸溶液磨成匀浆，倒入100mL容量瓶中，用1％草酸溶液稀释至刻度，混匀。
③ 将上述两液过滤，滤液备用。不易过滤的样品可用离心机沉淀后，倾出上清液，过滤，备用。
（2）氧化处理：取25mL上述滤液，加入0.5g活性炭，振摇1min，过滤，弃去最数毫升滤液。取10mL此氧化提取液，加入10mL 2％硫脲溶液，混匀。
（3）呈色反应：
① 于3个试管中各加入4mL稀释液。一个试管作为空白，在其余试管中加入1.0mL 2％2，4－二硝基苯肼溶液，将所有试管放入（37±0.5）℃恒温箱或水浴中，保温3h。
② 3h后取出，除空白管外，将所有试管放入冰水中。空白管取出后使其冷到室温，然后加入1.0mL 2％2，4－二硝基苯肼溶液，在室温中放置10～15min后放入冰水内。其余步骤同样品。
③ 85％硫酸处理：当试管放入冰水后，向每一试管中加入5mL 85％硫酸，滴加时间至少需要1min，需边加边摇动试管。将试管自冰水中取出，在室温放置30min后比色。
④ 比色：用1cm比色杯，以空白液调零点，于500nm波长测吸光值。
6. 计算
同荧光法。
7. 注意事项
（1）大多数植物组织内含有一种能破坏抗坏血酸的氧化酶，因此，抗坏血酸的测定应采用新鲜样品并尽快用2％草酸溶液制成匀浆以保存维生素C。
（2）若溶液中含有糖，硫酸加得太快，溶解热会使溶液变黑。
（3）试管自冰水中取出后，颜色会继续变深，所以，加入硫酸后30min应准时比色。

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