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食物中硒的测定（荧光法）

来源：- 北极虎网浏览：162 更新时间：2011年12月01日

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硒是人体必需微量元素之一，其测定方法有荧光法，中子活化法，原子荧光光度法，氢化物原子吸收光度法及比色法等。荧光法是采用比较多的方法，因为方法简单，准确度及灵敏度均较高，易于推广应用。本方法是测定食物中微量元素硒的国家标准方法。
1. 原理
样品经混合酸消化后，硒化合物被氧化为四价无机硒（Se4＋），与2，3－二氨基萘（2，3－diaminonaphthalene，简称为DAN）反应生成具有荧光的4，5－苯丙苤硒脑（4，5－benzo piaselenol），其荧光度与硒的浓度在一定的条件下成正比。用环己烷萃取后于激发光波长376nm、发射光波长520nm处测定荧光强度与绘制的标准曲线比较定量。本方法检出限为3ng。
2. 适用范围
依据GB/T 12399—1996食物中硒的测定方法。适用于各类食物中硒的测定。
3. 仪器和设备
（1）实验室常用设备。
（2）荧光分光光度计。
4. 试剂
除说明外均为分析纯。实验用水为去离子水。
（1）环己烷。
（2）硝酸。
（3）过氯酸。
（4）盐酸。
（5）氢溴酸。
（6）（1＋9）盐酸溶液。
（7）（1＋1）氨水。
（8）（5＋95）去硒硫酸。
① 去硒硫酸：取200mL硫酸，加于200mL水中，再加30mL氢溴酸，混匀，置砂浴上加热蒸去硒与水至出现浓白烟，此时体积应为220mL。
② 取5mL去硒硫酸，加入95mL水中。
（9）0.2mol/L EDTA溶液：将37gEDTA二钠盐，加水并加热溶解，冷却后稀释至500mL。
（10）10％盐酸羟胺：称取10g盐酸羟胺溶于水中，稀释至100mL。
（11）混合酸：硝酸＋过氯酸（2＋1）。
（12）0.1％ 2，3－二氨基萘（即DAN试剂）（纯度为95％～98％）：需在暗室配制，称取200mg DAN于一带盖三角瓶中，加入200mL 0.1mol/L盐酸，振摇约15min，使其全部溶解，约加40mL环己烷，继续振摇5min，将此液体转入分液漏斗中，待溶液分层后，弃去环己烷层，收集DNA层溶液。如此用环己烷纯化DNA直至环己烷中的荧光数值降至最低时为止[注意：纯化次数视DAN纯度不同而定，一般约需纯化3～4次]。将提纯后的DAN溶液贮于棕色瓶中，约加1cm厚的环己烷覆盖溶液表面。置冰箱保存。必要时再纯化一次。
（13）硒标准溶液：
① 硒标准贮备液（100μg/mL）：精确称取100.0mg元素硒（光谱纯），溶于少量硝酸中，加2mL过氯酸，置沸水浴中加热3～4h，冷却后加入8.4mL盐酸，再置沸水浴中煮2min。准确稀释至1000mL，其盐酸浓度为0.1mol/L。此贮备液浓度为100μg/mL。
② 硒标准使用液（0.05μg/mL）：将①液用0.1mol/L HCl稀释，使含硒为0.05μg/mL。于冰箱中保存。
（14）0.02％甲酚红指示剂：称取50mg甲酚红溶于水中，加（1＋1）氨水1滴，待甲酚红完全溶解后加水稀释至250mL。
（15）EDTA混合液：取0.2mol/L的EDTA(9）和10％盐酸羟氨（10）液各50mL，混匀，再加5mL（14）溶液，用水稀释至1L。
5. 操作步骤
（1）样品处理及消化：
① 粮食：样品用水洗3次，于60℃烘干，用不锈钢磨磨成粉，贮于塑料瓶内，放一小包樟脑精，盖紧盖保存，备用。
② 蔬菜及其他植物性食物：取可食部分用水冲洗3次后用纱布吸去水滴，用不锈钢刀切碎，取混合均匀的样品于60℃烘干，称重，粉碎，备用。
③ 称取0.5～2.0g样品（含硒量0.01～0.05μg）于磨口三角瓶内，加10mL（5＋95）去硒硫酸，样品润湿后，再加20mL混合酸液放置过夜。次日于砂浴上逐渐加热，当激烈反应后（溶液变无色），继续加热至产生白烟，溶液逐渐变成淡黄色即达到终点。某些蔬菜样品消化后常出现浑浊，难以确定终点，所以要细心观察。另外，含硒较高的蔬菜含有较多的Se6＋，需要在消化达到终点时冷却后加10mL（1＋9）盐酸，继续加热，使Se6＋还原成Se4＋。同样按上述方法确定终点。
（2）测定：于样品消化液中加20mL EDTA混合液，用氨水（1＋1）或盐酸调至淡红橙色（pH1.5～2.0）。以下步骤在暗室进行：加3mL DAN试剂，混匀，置沸水浴中煮5min，取出立即冷却，加3mL环己烷，振摇4min，将全部溶液移入分液漏斗，待分层后弃去水层，环己烷层转入带盖试管中，小心勿使环己烷中混入水滴，于激发光波长376nm，发射光波长520nm处测定4，5－苯丙苤硒脑的荧光强度。
（3）硒标准曲线绘制：准确吸取硒标准使用液0、0.2、1.0、2.0mL及4.0mL加水至5mL，按样品测定步骤同时进行。硒含量在0.5μg以下时荧光强度与硒含量呈线性关系，在常规测定样品时，每次需做试剂空白与样品硒含量相近的标准管（双份）即可。
6. 计算

式中 x——样品中硒含量，μg/g；
A——标准管荧光读数；
B——空白管荧光读数；
C——样品管荧光读数；
m1——标准管中硒质量，μg；
m2——试样质量，g。
7. 注意事项
（1）结果的允许差：同一实验室平行测定或重复测定结果相对偏差绝对值≤10％。
（2）硒含量在0.5μg以下荧光强度与硒含量呈线性关系，超过0.5μg时为非线性关系，故硒含量应控制在0.5μg以内。硒含量过高时要先用环己烷稀释，再测定荧光。
（3）我国高硒地区食物样品中的硒，多以Se6＋形式存在，故应在消化到终点后，加（1＋9）HCl还原继续消化至终点使其Se6＋转变为Se4＋后再测定。

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