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性激素的测定方法（高效液相色谱法）

来源：- 北京虎网浏览：394 更新时间：2011年12月01日

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本方法适用于食品中的雌二醇、雌三醇、雌酮、睾酮、孕酮、己烯雌酚的测定。
本方法最低检出量：雌三醇9.0ng，雌二醇38.0ng，雌酮44.0ng，睾酮20.0，孕酮71.0ng，己烯雌酚16.0ng。
1. 方法提要
食品中的性激素用有机溶剂提取，固-液、液-液分配萃取净化，高效液相色谱测定，与标准品的保留时间比较定性，内标法定量。
2. 仪器
（1）Waters—2690型高效液相色谱低度，996二极管阵列检测器。
（2）离心机。
（3）超声波提取器。
3. 试剂
本方法所使用试剂除特殊注明外均为分析纯；实验用水为去离子水或同等纯度蒸馏水。
（1）醋酸钠缓冲液：取1000mL0.2mol/L醋酸钠溶液与1000mL0.2mol/L醋酸溶液混合，以酸度计测定并用醋酸逐渐调至pH5.2。
（2）碳酸钠缓冲液：取200g/L碳酸钠溶液150mL与80g/L碳酸氢钠溶液1000mL混合，以酸度计测定并用碳酸钠逐渐调至pH0.5。
（3）内标储备液：准确称取安眠酮0.1000g，置于100mL容量瓶中，用优级纯甲醇溶解并定容至刻度，混匀。此溶液每1mL含安眠酮1.0mg。置冰箱中保存。
（4）内标使用液：准确吸取内标储存液1.0mL置于100mL容量瓶中，用优级纯甲醇溶解并定容至刻度，混匀。此溶液每1mL含安眠酮10.0μg。
（5）激素标准储备液：分别准确称取雌三醇、雌二醇、雌酮、睾酮、孕酮、己烯雌酚标准品0.1000g置于100mL容量瓶中，用优级纯甲醇溶解并定容至刻度，混匀。此溶液每1mL含上述激素均为1.00mg，置冰箱中保存。
（6）激素+内标标准混合使用液：准确吸取10.0mL激素标准储备液和内标储备液用优级纯甲醇配制成每1mL含各种激素100.0μg、安眠酮100.0μg的标准混合使用液。
（7）溶剂：甲醇，丙酮，乙醚，二氯甲烷。
（8）无水硫酸钠。
（9）硅胶：层析用
（10）中性氧化铝：层析用。
4. 测定步骤
（1）样品处理：
a. 固体样品：将固体食品混合均匀后准确称取50g左右，置于300mL具塞锥形瓶中，加少量水润湿，在样品中加入每1mL含10.0μg的内标使用液1.0mL，加甲醇+丙酮（1+1）混合液150mL，超声提取30min（或振摇提取45min），用快速滤纸过滤，滤纸及残渣用甲醇+丙酮（1+1）混合液少量洗涤数次，洗液并入滤液中，水浴上挥干溶剂。残渣用甲醇20mL溶解。溶解液经过盛有少量无水硫酸钠、中性氧化铝、硅胶的漏斗滤入250mL分液漏斗中，再用10mL甲醇分数次洗涤漏斗及内容物，洗液并入滤液中，加醋酸钠缓冲液100mL，混匀后用二氯甲烷50、30、30mL振摇15min，提取3次。合并提取液于另一250mL分液斗中，加醋酸钠缓冲液30mL，振摇洗涤20min，静置，弃水层。二氮甲烷层用水振摇洗涤3次，每次加水20mL，弃水层，二氯甲烷用无水硫酸钠过滤脱水，在水浴上挥干溶剂。残渣用优级纯甲醇溶解并定容至1.0mL，混匀后取上清液供液相色谱测定用。
b. 液体样品：准确吸取液体样品100~150mL左右置于250mL分液漏斗中，加内标使用液1.0mL，混匀后用500g/L醋酸钠溶液调至pH5.2左右，用50、30、30mL乙醚提取3次，合并提取液于水浴上挥干溶剂。残渣用甲醇20mL溶解，以下按4.(1)a项下自“经过盛有少量无水硫酸钠、中性氧化铝、硅胶的漏斗滤入250ml分液漏斗中”起操作。
（2）色谱分离条件：
色谱柱：HP—ODS 4.6mm×200mm。
测定波长：270nm。
流动相：乙腈（色谱纯）+甲醇（色谱纯）+四氢呋喃（重蒸）+0.01mol/L醋酸钠溶液（超纯水配制）=20+20+10+50。
流速：1.0mL/min。
进料量：20μL。
（3）标准曲线的绘制：准确吸取标准混合使用液、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0分别置于50mL容量瓶中，用优级纯甲醇稀释至刻度，混匀后分别取20μL注入高效液相色谱仪中，以内标法绘制标准曲线。各组分标准曲线的回归方程式为：雌三醇y=175.5x+47.9，雌二醇y=97.3x+27.1，雌酮98.8x+5.7，睾酮y=148.3x+24.6，孕酮y=71.6x+6.5，己烯雌酚y=185.8x+27.2。
（4）样品测定：取供色谱分析的样品溶液20μL，注入高效液相色谱仪，与标准的保留时间比较定性，内标法定量。
标准品色谱图见图2-28，样品色谱图见图2-29。

序号	名　称	保留时间/min	面积	峰　高	序号	名　称	保留时间/min	面　积	峰　高
1	雌三醇	2.876	19274	2186	5	雌酮	8.259	39263	2182
2	安眠酮	4.212	44031	4540	6	己烯雌酚	13.969	104125	4480
3	睾　酮	6.573	34366	2648	7	孕酮	16.192	24481	1097
4	雌二醇	7.090	20280	1482

名称	保留时间/min	面　　积	峰　　高	名称	保留时间/min	面　　积	峰　　高
1	2.876			5	8.259
2	4.212			6	13.996	8382	478
3	6.526	21485	2014	7	15.967	23442	1064
4	6.980	17050	1322

5. 结果计算

式中 X——样品中性激素含量（μg/g）；
c——由内标法得出的测定样液中性激素的浓度（μg/mL）；
V——样品测定溶液总体积（mL）；
m——样品质量（g）。
6. 准确度与精密度
在一样品中分别加入不同浓度的激素标准品，进行激素多组份同时加标回收试验，多种激素的回收率分别为：雌三醇79.0%~99.1%，雌二醇83.3%~100.9%，雌酮85.3%~100.8%，睾酮80.0%~106.3%，孕酮85.0%~102.0%，己烯雌酚87.1%~101.5%。不同实验室对同一样品进行10次测定结果的相对标准偏差分别为雌三醇6.4%，雌二醇5.1%，雌酮9.9%，睾酮11.7%，孕酮5.1%，己烯雌酚5.5%。
7. 注释
（1）本文所测定的性激素为类固醇激素，也称甾体激素，从结构上分为3类：18-碳雌烃系，19-碳雄烯烃系，21-碳孕烃系。雌二醇（Oestradiol）、雌三醇(Oetriol)、雌酮(Oestronl)、己烯雌酚(Hexestro)为18-碳雌烃系，睾酮（Testosteronl）为19-碳雄烯烃系，孕酮（Progesteronl）为21-碳孕烃系。雌二醇、雌三醇、雌酮是由卵泡和黄体所分泌的天然激素，生理活性最强的为雌二醇。雌三醇和雌酮是雌二醇的代谢产物。雌二醇、雌三醇、雌酮的活性比是100：10：3。己烯雌酚是人工合成激素，其生理活性比天然雌激素强很多；睾酮是雄性激素作用的物质，由男性的睾丸组织中分泌产生，女性则由肾上腺皮质产生；孕酮是由卵巢的黄体产生，肾上腺皮质也能制造微量孕酮。上述性激素具有调节机体不同功能的作用，有的具有抗疲劳、延缓衰老、促进生长发育、改善性功能等保健作用，特别是对绝经后的妇女可缓解更年期综合征、预防骨质疏松；但性激素在长期毒性实验过程中也显示了致肿瘤作用。
（2）类固醇激素一般是白色结晶或白色粉末，不溶于水，易溶于乙醚、乙醇、丙酮、二氯甲烷等有机溶剂，可根据被测组分与食品中干扰物质的性质差异，选用不同的溶剂将激素从样品中提取出来。
（3）高效液相色谱分析时，大量的酸性物质干扰雌三醇测定，碳酸钠缓冲液洗涤二氯甲烷提取液，能有效除去非激素类强酸性杂质干扰。
（4）流动相中四氢呋喃比例可在12%~18%之间调节，当样品中杂峰对雌三醇干扰严重的应降低四氢呋喃比例。
（5）雌三醇、雌二醇、雌酮在230nm波长处有较大吸收；睾酮、孕酮和己烯雌酚在240~250nm波长处有最大吸收。本方法进行多组分测定时选用230nm或270nm为检测波长，前者灵敏度高，尤其对分析睾酮，但杂峰干扰严重。如果所用检测器具有多波长，可选用260nm和280nm双波长检测分析效果更好。
（6）某些保健食品添加了许多中草药，含有多种甾体成分，其主体结构与性激素相似，分析时，每个样品必须进行加标试验，样品预处理可采用硅胶-氧化铝混合柱，聚酰胺，C18柱等进行预分离，可得到满意效果。
（7）激素各组分的标准曲线线性范围均在1~30.0μg/mL，标准曲线回归分析的相关系数（r）均能达到0.999以上。

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