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类胡萝卜素的测定方法（高效液相色谱法）

来源：- 北京虎网浏览：162 更新时间：2011年12月01日

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本方法适用于各类食品中以羟基类胡萝卜素为主的多种类胡萝卜素的测定。
本方法最低检出量为：α-胡萝卜素为5ng/mL，β-胡萝卜素为4.3ng/mL，γ-胡萝卜素为3.5ng/mL，番茄红素为2.7ng/mL，斑蝥黄素为1.0ng/mL。
1. 方法提要
样品以丙酮-石油醚（1+1体积比）混合溶剂反复萃取使类胡萝卜素与其他成分分离，在450nm波长条件下进行HPLC分析检测，通过外标法计算各种类胡萝卜素的含量。
2. 仪器
（1）高效液相色谱仪。
（2）冷凝回流皂化装置。
（3）旋转蒸发仪。
（4）离心机（5000r/min）。
3. 试剂
本方法所使用试剂除特殊注明外，均为分析纯；所用水为重蒸馏水。
（1）丙酮-石油醚（1+1体积比）混合溶剂：取相同体积的丙酮、石油醚混匀。
（2）50% KOH甲醇-水溶液：称取250g氢氧化钾，用50mL适量水溶解后，用甲醇定容至500mL容量瓶，备用。
（3）无水硫酸钠（Na2SO4）。
（4）二丁基羟基甲苯（BHT）。
（5）无水乙醇（C2H5OH）。
（6）流动相使用液：按乙腈+二氯甲烷+甲醇（85+10+5）比例准确量取各溶剂，并充分混匀，经.45μm微孔膜过滤后使用。
（7）类胡萝卜素标样：α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、番茄红素、斑蝥黄素。
（8）标准溶液：准确称取α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、番茄红素、斑蝥黄素一定量，先分别用少量的乙酸乙酯溶解，再用甲醇配制成60~80ng/L的标准储备液（于-30℃冻箱保存），使用时再配成3.5~16.5mg/L的标准使用液。
4. 测定步骤
（1）样品处理：
a. 皂化提取法（如牛奶等脂肪含量较高的样品）：取250L鲜牛奶于2℃、5000r/min冷冻离心30min，取上层油脂于250mL皂化瓶中，加入50mL乙醇、40mL 50% KOH甲醇溶液、0.1g BHT，65~75℃回流皂化30min，用石油醚反复提取皂化液，多次水洗至中性后用无水硫酸钠脱水，定容至25mL容量瓶中，备用。
b. 直接提取法（如番茄等脂肪含量较低的样品）：适量新鲜成熟番茄匀浆后称取5~10mg于小烧杯中，加入0.1g BHT，用丙酮-石油醚（1+1体积比）混合溶剂提取3次，合并、收集上层有机相，反复水洗后，用无水硫酸钠脱水，定容至25mL容量瓶中，备用。
取上述提取液20mL减压蒸干，用1mL甲醇溶解，经0.45μm微孔膜过滤后待测。
（2）色谱分离条件：
色谱柱：μ-Bondapak C18(3.9mm×150mm)。
流动相：乙腈+二氯甲烷+甲醇（85+10+5）。
流速：0.6mL/min。
检测器波长：150nm(0.64AUFS)。
进样量：20μL。
柱温：18℃。
（3）样品测定：准确吸取样品处理液和类胡萝卜标准混合使用液10μL注入高效液相色谱仪进行分离，以其标准溶液出峰的保留时间定性，以其峰面积或峰高计算样液中各类胡萝卜素的含量。
5种类胡萝卜的标准色谱图见图2-19，番茄样品色谱图见图2-20。
5. 结果计算
根据各标准样品的保留时间和峰面积或峰高，分别对样品中各类胡萝卜素进行定性与定量。
6. 准确度与精密度
在不同食品中进行不同浓度加标回收实验、精密度与重复性实验，α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、番茄红素、斑蝥黄素5种类胡萝卜素的回收率分别为：89.8%~95.5%、90.4%~98.7%、89.7%~95.3%、90.8%~96.4%、92.6%~101.1%。相对标准差（RSD）分别为：2.5%~7.6%、1.8%~8.1%、8.9%~9.1%、4.0%~6.3%、2.9%~4.1%。其线性相关系数（r）依次为0.9980, 0.9986, 0.9993, 0.9995, 0.9988(n=7)。
7. 注释
（1）类胡萝卜素见光、遇氧容易被破坏，所以标样最好随配随用，或配制高浓度储备液冲氮低温冻藏，使用时配制一定低浓度的工作使用液。样品的整个提取、分析过程应在黄色弱光中操作。
（2）在处理大量试样或放置时间较长时，要加抗氧化剂（BHT、BHA）。
（3）在反复提取皂化液时会发生乳化现象，有时难以分离。可滴加无水乙醇，以达到分离效果。
（4）本方法较适合于羟基类胡萝卜素的分析测定，对氧合羟基类胡萝卜素的分离、分析效果较差。

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